活性氧通路在高糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1中的作用.pdf

1、背景:
　　持續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritonealdialysis,CAPD)是目前終末期腎病的主要替代治療方法之一,長(zhǎng)期透析治療所導(dǎo)致的腹膜纖維化(peritoneal dialysis,PF)和超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)是患者退出腹膜透析的主要原因。國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí),腹透液中高濃度葡萄糖的長(zhǎng)期應(yīng)用是導(dǎo)致腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的重要原因,然

2、而其具體發(fā)生機(jī)制至今尚未完全闡明。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)是生物體內(nèi)一類活性含氧化合物的總稱,主要包括超氧陰離子自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)、單線態(tài)氧(1O2)和過(guò)氧化脂質(zhì)(LOOH)等。ROS除了能直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用外,還能作為信號(hào)傳遞分子通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)調(diào)控某些基因的表達(dá)。
　　在糖尿病腎病研究中已經(jīng)證實(shí)ROS可通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如蛋白激酶

3、C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1),并上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纖維連接素(FN)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等基因和蛋白的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)腎臟纖維化。TGF-β1是目前公認(rèn)的一種強(qiáng)效致纖維化因子,在高糖誘導(dǎo)腹膜纖維化的形成過(guò)程中起著非常重要的作用。因而我們猜測(cè),ROS可能作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在高

4、糖誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞(humanperitoneal mesothelial cells,HPMCs)分泌TGF-β1過(guò)程中起到一定的介導(dǎo)作用,但是目前尚缺乏直接的研究證據(jù)。目的:本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究高糖對(duì)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)以及產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的影響,同時(shí)應(yīng)用不同濃度的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對(duì)其進(jìn)行干預(yù),以探討ROS信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)人腹膜間

5、皮細(xì)胞分泌TGF-β1過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　采用胰蛋白酶消化法從人網(wǎng)膜組織標(biāo)本中分離HPMCs,用15％FBS-DMEM培養(yǎng)基于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并進(jìn)行倒置相差顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求將HPMCs隨機(jī)分組:
　　1.高糖組(含1.5%、2.5%、4.25%D-葡萄糖),同時(shí)設(shè)正常無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照組(含0.1%D-葡萄糖),各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24

6、h;對(duì)照組與1.5%高糖組分別培養(yǎng)12h、24h和48h;
　　2.NAC處理組(含0.1mM、1.0mM、10mM NAC),同時(shí)設(shè)不含NAC的正常無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照組(含0mMNAC),各組細(xì)胞分別用NAC預(yù)處理1h,然后再用1.5%高糖培養(yǎng)24h。
　　檢測(cè)方法:
　　1.采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)各組樣品細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TG

7、F-β1的蛋白分泌量;
　　2.腹膜間皮細(xì)胞原位裝載熒光探針2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)后,采用DCF法檢測(cè)各組樣品細(xì)胞中ROS的生成量:①用熒光顯微鏡直接觀察各組樣品細(xì)胞中DCF的熒光強(qiáng)度;②用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各組樣品細(xì)胞中DCF的相對(duì)熒光強(qiáng)度(relative fluorescence intensity,RFI),從而

8、間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的相對(duì)水平。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)鑒定,96%以上的培養(yǎng)細(xì)胞為HPMCs。
　　2.高糖可顯著誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞分泌TGF-β1,并呈濃度及時(shí)間依賴性(P<0.05),其中4.25%高糖組及培養(yǎng)48h組誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1蛋白分泌量最高。
　　3.高糖可顯著刺激人腹膜間皮細(xì)胞生成活性氧(ROS),并呈濃度及時(shí)間依賴性(P<0.05),其中4.25%高糖組及培養(yǎng)48h組刺激人腹膜間皮

9、細(xì)胞內(nèi)ROS生成量最高。
　　4.抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后,可明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成量,同時(shí)顯著抑制TGF-β1的分泌,并呈濃度依賴性(P<0.05),其中10mM NAC組抑制作用最明顯。
　　結(jié)論:
　　1.高糖可顯著誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1分泌增加,抗氧化劑可抑制高糖誘導(dǎo)的TGF-β1分泌。
　　2.高糖可顯著刺激人腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加,抗氧化劑可抑制高糖誘導(dǎo)的ROS生成。
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