槲皮素通便功能機制研究及松針槲皮素提取工藝的優(yōu)化研究.pdf

1、背景與目的:
　　慢性傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是慢性便秘中最常見的一種，是結(jié)腸傳輸功能障礙導(dǎo)致的腸動力減弱、腸內(nèi)容物傳輸緩慢的頑固性便秘，主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少和便意減弱甚至消失，多數(shù)患者伴有腹脹、納呆等癥狀。目前已有研究針對這些因素進行STC的調(diào)理和干預(yù)，但效果并不理想。因此探討STC的發(fā)病機制，繼而采取對因治療成為目前研究熱點。
　　然而STC的發(fā)病機制尚不清楚。近年來，對

2、STC的機制研究有了新的方向。有研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜上皮的功能在STC的發(fā)生和發(fā)展的過程中有著重要的作用。首先，正常的腸黏膜上皮是組成腸屏障功能最重要的組成部分。一旦腸屏障受到破壞，會出現(xiàn)腸功能障礙。其次，腸粘膜上皮能夠調(diào)節(jié)腸內(nèi)激素、液體的分泌，從而影響腸道的蠕動。同時，STC中水通道蛋白（AQPs）表達(dá)的增高使結(jié)腸黏膜增加了對腸內(nèi)容物水分的吸收，使糞便變得干硬而難以排出。此外，腸黏膜上皮上的乳酸菌、雙歧桿菌等能競爭性抑制腸道中的致病菌，也

3、能分泌丁酸為腸上皮提供70％的能量，為腸道功能提供動力。因此，維護腸黏膜上皮的完整性和保護腸黏膜上皮功能對治療STC有著不可忽視的作用。
　　具有抗氧化、抗炎作用的藥物和天然產(chǎn)物能夠有效地防止腸黏膜受到自由基、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的破壞，保護腸黏膜的完整性，從而促進STC腸道功能的恢復(fù)。由于對STC的防治需要長時間的干預(yù)，因此在選擇治療藥物上更傾向于使用食用安全范圍更廣的天然產(chǎn)物。因此，探求一種長期有效且無毒副作用的天然產(chǎn)物具有重要

4、意義。
　　槲皮素（Quercetin）是黃酮類物質(zhì)的主要成分，來源廣泛，具有抗氧化、抗炎及抗感染抗腫瘤等多種生物活性作用。現(xiàn)代藥理試驗表明槲皮素對心血管疾病、糖尿病、腫瘤等慢性疾病有積極的防治作用，同時，研究也證實槲皮素對人體無毒無害、無致畸性和致癌性，長期食用安全性高。故槲皮素可作為保護腸黏膜，促進腸道功能的恢復(fù)，緩解慢性傳輸性便秘的原料。
　　本研究擬考察槲皮素對慢性傳輸性便秘小鼠的通便作用，并研究槲皮素保護腸黏膜，緩

5、解STC的機制，以及對松針中的槲皮素進行提取分離，為食物輔助治療便秘和通便功能食品的研制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.小鼠慢性傳輸性便秘模型的建立
　　1.1 使用復(fù)方地芬諾酯片混懸液，灌胃小鼠建立慢性傳輸性便秘模型
　　1.2 小鼠排便情況評價
　　觀察記錄每只小鼠首次排黑便時間、6h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量并觀察黑便的性狀。
　　1.3 制作小鼠結(jié)腸組織病理切片，觀察小鼠結(jié)腸病理切片變化。

6、　　2.槲皮素通便功能的評價
　　2.1 觀察槲皮素對各組小鼠的首次排黑便時間，6h內(nèi)排便粒數(shù)和重量，腸內(nèi)容物的粒數(shù)和重量的影響，來評價槲皮素的通便效果。
　　2.2 測定小鼠血清中丙二醛（MDA）的含量。
　　2.3 制作小鼠結(jié)腸組織病理切片，觀察各組小鼠結(jié)腸病理切片變化。
　　3.槲皮素對腸道菌群的影響
　　3.1 使用平板計數(shù)法測定小鼠結(jié)腸內(nèi)容物和糞便中腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳酸菌的含量。

7、　　3.2 測定小鼠血清中乳酸的含量。
　　3.3 測定小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的pH值
　　3.4 測定小鼠結(jié)腸TNF-α、IL-6、EGF的mRNA的表達(dá)
　　4.松針中槲皮素的優(yōu)化提取和分離
　　4.1 松針蘆丁的優(yōu)化提取
　　使用響應(yīng)面法中的中心復(fù)合設(shè)計優(yōu)化提取松針中蘆丁的工藝參數(shù)，用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法檢測蘆丁提取液的含量。
　　4.2 粗槲皮素的制備
　　按優(yōu)化的提取工藝條件，得到蘆丁提取液

8、，然后濃縮至無醇味，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，置冷柜過夜使晶體析出，離心，去上清。沉淀放置在干燥箱60℃下干燥約12小時，粗槲皮素。
　　4.3 精槲皮素的制備
　　取粗槲皮素，加2%H2SO4溶液直火加熱至微沸，析出鮮黃色沉淀。冷卻，離心，去上清，將沉淀水洗成中性。沉淀干燥，得精槲皮素。
　　4.4 定性分析
　　4.4.1 三氯化鐵試驗檢測樣本的酚類化合物。
　　4.4.2 鹽酸-鎂粉試驗檢測樣本的黃酮成分。<

9、br>　　4.4.3 Molish反應(yīng)試驗檢測樣本的糖類物質(zhì)。
　　4.5 高效液相色譜法（HPLC）定量分析
　　使用HPLC法對粗槲皮素和精槲皮素兩樣本中的蘆丁與槲皮素進行定性定量分析。
　　5.方法學(xué)考察
　　通過重復(fù)性實驗、精密度實驗、穩(wěn)定性實驗檢驗儀器、樣品和實驗方法。
　　結(jié)果：
　　1小鼠慢性傳輸性便秘模型的建立
　　1.1小鼠排便情況評價
　　復(fù)方地芬諾酯能夠明顯延長小鼠首

10、次排黑便用時、減少小鼠6h內(nèi)總排便重量和粒數(shù)（P<0.05），符合STC的特點。
　　1.2 制作小鼠結(jié)腸組織病理切片，觀察小鼠結(jié)腸病理切片變化。
　　STC能導(dǎo)致小鼠結(jié)腸絨毛減少，腸壁變薄，腺體腔變窄，腺體萎縮。
　　2.槲皮素通便功能的評價
　　2.1 槲皮素能夠明顯縮短小鼠首次排黑便用時、增加小鼠6h內(nèi)總排便重量和粒數(shù)（P<0.05）說明槲皮素有通便效果。
　　2.2 槲皮素能夠明顯降低小鼠血清中丙二

11、醛（MDA）的含量（P<0.05）。
　　2.3 各組小鼠結(jié)腸組織病理變化，松針劑量組結(jié)腸較為正常，且結(jié)腸絨毛、消化細(xì)胞及腺體與模型組比較增多。
　　3.槲皮素對腸道菌群的影響
　　3.1 與便秘組比較，灌服100mg/kg和400mg/kg的槲皮素能明顯增加小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌菌落數(shù)（P<0.05），能夠顯著減少腸球菌的菌落數(shù)（P<0.05）。
　　3.2 槲皮素對腸道菌群的影響。
　　灌服100-400m

12、g/kg槲皮素能夠明顯增加小鼠血清中乳酸的含量（P<0.05）。
　　3.3 各測定小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的pH值
　　各劑量組均能明顯降低結(jié)腸內(nèi)容物的pH值（P<0.05）。
　　3.4 測定小鼠結(jié)腸TNF-α、IL-6、EGF的mRNA的表達(dá)
　　各劑量組均能明顯降低結(jié)腸的TNF-α的mRNA的表達(dá)（P<0.05），劑量1、3、4組能明顯降低結(jié)腸的IL-6的mRNA的表達(dá)（P<0.05），劑量4組能明顯提高EGF的m

13、RNA的表達(dá)（P<0.05）。
　　4.松針中槲皮素的優(yōu)化提取和分離
　　4.1 松針蘆丁的優(yōu)化提取
　　得到松針中蘆丁的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為30%，料液比為1:50（g：ml），提取溫度為65℃，提取時間為120min。松針中蘆丁提取率的預(yù)測值為10.28%。
　　4.2 定性分析
　　4.2.1 三氯化鐵試驗檢測樣本的酚類化合物。
　　蘆丁提取液、粗槲皮素與精槲皮素溶液加入三氯化鐵乙醇溶

14、液后，均能觀察到溶液變藍(lán)綠，表明三者均含有酚類化合物。
　　4.2.2 鹽酸-鎂粉試驗檢測樣本的黃酮成分。
　　蘆丁提取液、粗槲皮素與精槲皮素溶液加入鎂粉與濃鹽酸后，對比空白管，三者均呈現(xiàn)呈橙紅至紫紅色。表明三者均含有黃酮類物質(zhì)。
　　4.2.3 Molish反應(yīng)試驗檢測樣本的糖類物質(zhì)。
　　蘆丁提取液和濃硫酸的液面間形成紫環(huán)，反應(yīng)為陽性，含有糖類物質(zhì)。粗槲皮素與精槲皮素溶液未能觀察到液面間紫環(huán)，反應(yīng)為陰性，不含

15、有糖類物質(zhì)。
　　4.3 高效液相色譜法（HPLC）定性定量分析
　　4.3.1 定性分析
　　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為2.65-3.05min，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為7.42-7.82min。粗槲皮素溶液含蘆丁與槲皮素，精槲皮素溶液含槲皮素，不含蘆丁。
　　4.3.2 定量分析
　　粗槲皮素溶液含蘆丁濃度為1.48×10-3mg/mL與槲皮素1.94×10-3，精槲皮素溶液含槲皮素3.96×10-3，在酸