脂質(zhì)體槲皮素的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：槲皮素(qu．ercetin；3,3',4',5,7-pentahydroxynaVone)是天然的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜及水果，具有抗增生、抗腫瘤作用，并影響多種酶的生物活性，是一種潛在的化療藥物。由于槲皮素不溶于水，難于吸收，極大地限制了其在體內(nèi)運(yùn)用。脂質(zhì)體作為新型藥物載體，能包裹抗生素、抗真菌藥、化療藥物、生物制劑等，能改變藥物的水溶性、體內(nèi)分布和體內(nèi)代謝。用親水性材料如聚乙二醇(polyethylene glycol

2、，PEG)將脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾后，脂質(zhì)體穩(wěn)定增加，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，我們將不溶于水的槲皮素通過(guò)用脂質(zhì)體包裹，制備成脂質(zhì)體槲皮素(quercetinencapsulated by pegylated liposomes，Q-PEGL)，觀察其在荷瘤小鼠體內(nèi)分布，體內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)，潛在的抗腫瘤機(jī)制。 方法：1：通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體槲皮素，檢測(cè)脂質(zhì)體槲皮素的理化特性。2：在荷瘤BALB/c(接種結(jié)腸癌CT26細(xì)胞)分

3、別通過(guò)尾靜脈給予50mg/kg游離槲皮素或脂質(zhì)體槲皮素，不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠。收集血漿，腫瘤組織及正常組織器官，通過(guò)HPLC檢測(cè)這些血漿，腫瘤組織，組織器官中槲皮素的含量，分析槲皮素在血漿半率期和在體內(nèi)分布。3：用脂質(zhì)體槲皮素或游離槲皮素處理小鼠結(jié)腸腺癌CT26，Lewis肺癌EL/2，人臍內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的活性、細(xì)胞周期分布、觀察形態(tài)。4：用不同劑量的脂質(zhì)體槲皮素治療荷瘤BALB/c(接種結(jié)腸癌CT26細(xì)胞)小鼠，觀察最佳的治療劑量。

4、5：分別用BALB／c(接種結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26)和C57BL/6N小鼠(接種lewis肺腺癌系LL／2)建立荷瘤小鼠動(dòng)物模型。將每種荷瘤小鼠模型隨機(jī)分為4個(gè)治療組即：脂質(zhì)體槲皮素組；游離槲皮素組；DDP組；PBS對(duì)照組，觀察小鼠腫瘤體積和生存時(shí)間。6：分別用脂質(zhì)體槲皮素、DDP、PBS對(duì)照組處理荷瘤BALB／c(接種小鼠肝癌細(xì)胞系H22)腹水模型，觀察小鼠腫瘤體重和生存時(shí)間，腹腔滲透性。7：CD31免疫組化觀察腫瘤血管生成、通過(guò)TUN

5、EL法檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞凋亡、定量RT-PCR檢測(cè)腫瘤組織中：HSP70的含量。8：同時(shí)觀察槲皮素可能的副作用。 結(jié)果：1：脂質(zhì)體槲皮素粒徑大小為130±20nm，包封率為85％。然后將脂質(zhì)體槲皮素用5％葡萄糖液溶解后放入4℃的冰箱中放置1月無(wú)沉淀析出。2：槲皮素在荷瘤小鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)和分布實(shí)驗(yàn)表明用脂質(zhì)體槲皮素在體內(nèi)血漿半衰期較游離槲皮素長(zhǎng)，脂質(zhì)體槲皮素組較游離槲皮素組有較長(zhǎng)時(shí)間較高濃度槲皮素在腫瘤組織內(nèi)積聚。表明的槲皮素納米

6、脂質(zhì)體包裹后改善了槲皮素的水溶性而且還初步具有靶向性。3：體外抗腫瘤研究結(jié)果提示脂質(zhì)體槲皮素同游離的槲皮素一樣具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。4：體內(nèi)劑量篩選結(jié)果提示槲皮素抑制腫瘤生長(zhǎng)與劑量相關(guān)。50mg／kg槲皮素劑量能效好地抑制腫瘤生長(zhǎng)。5：兩種動(dòng)物模型抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂質(zhì)體槲皮素組比游離槲皮素組更能顯著地抑制了腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性(P<0.05)。6：脂質(zhì)體槲皮素能有效的抑制

7、肝癌腹水模型小鼠模型體重增加，延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低腹腔的滲透性。7：免疫組化證實(shí)脂質(zhì)體槲皮素的抗腫瘤機(jī)制涉及抗腫瘤新生血管作用。采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況，脂質(zhì)體槲皮素組腫瘤組織中熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞明顯高于PBS組(P<0.01)，脂質(zhì)體槲皮素治療組與單用順鉑治療組細(xì)胞凋亡百分率相比，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無(wú)顯著性(P>0.05)。病理切片上脂質(zhì)體槲皮素組和順鉑治療組可見腫瘤組織壞死明顯，PBS對(duì)照組腫瘤組織只有少

8、量壞死，正常的毛細(xì)血管圍繞著排列混亂的腫瘤細(xì)胞。定量RT-PCR表明脂質(zhì)體槲皮素在腫瘤組織中具有抑制腫瘤細(xì)胞中HSP70的表達(dá)。8：脂質(zhì)體槲皮素治療中未觀察到動(dòng)物如體重、卷毛、食欲及活動(dòng)等變化。鏡下未觀察到各器官組織細(xì)胞形態(tài)改變。 結(jié)論： 1．槲皮素被脂質(zhì)體包裹后改變了槲皮素的水溶性，測(cè)定脂質(zhì)體槲皮素的電荷-3mv，粒徑大d~1304-20nm，包封率85％； 2．證實(shí)脂質(zhì)體槲皮素在體外具有抗腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增

9、殖的作用； 3．證實(shí)槲皮素脂被脂質(zhì)體包裹后血漿半率期延長(zhǎng)，有效地積聚在腫瘤部位，改善了槲皮素在體內(nèi)分布； 4．證實(shí)脂質(zhì)體槲皮素抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)呈劑量相關(guān)； 5．證實(shí)了脂質(zhì)體槲皮素抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低腹腔滲透性； 6．證實(shí)了脂質(zhì)體槲皮素抗腫瘤機(jī)制與增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，降低熱休克蛋白70表達(dá)，抑制腫瘤血管形成有關(guān)； 7．長(zhǎng)期觀察并沒有觀察到嚴(yán)重的毒性的反應(yīng)，證實(shí)了脂質(zhì)體槲皮素是