小劑量槲皮素聯(lián)合順鉑對惡性黑素瘤A375細胞抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文小劑量槲皮素聯(lián)合順鉑對惡性黑素瘤A375細胞抗腫瘤作用的實驗研究姓名：高聰普申請學位級別：碩士專業(yè)：皮膚病與性病學指導教師：于建斌20060501鄭州大學2006屆碩士畢業(yè)論文摘要惡性黑素瘤化療敏感性還未見報道。本實驗以小劑量槲皮素及順鉑處理惡性黑素瘤A375細胞系，探討小劑量槲皮素能否增加順鉑對惡性黑素瘤增強化療敏感性及其可能的機制，為臨床治療尋找新的治療途徑，積累研究資料和提供實驗依據(jù)。方法：1細胞培養(yǎng)：本實驗采

2、用A375細胞傳代貼壁培養(yǎng)，接種入24孔培養(yǎng)板，在細胞對數(shù)生長期，隨機將24孔分為4組。對照組：加不含順鉑和槲皮素的培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM)；槲皮素組：加入含槲皮素(槲皮素終濃度為30岬ol／L)的培養(yǎng)基：順鉑組：加入含順鉑(終濃度為1mol／L)的培養(yǎng)基；聯(lián)合組：同時加入含槲皮素，順鉑(終濃度：槲皮素30肛m01／L，順鉑1“m01／L)培養(yǎng)基。4組細胞同時培養(yǎng)36h。2生長抑制率檢測：細胞培養(yǎng)及細胞分組如前述，先棄去培養(yǎng)

3、液，24孔板每孔加入O2m10，005％胰蛋白酶O02％EDTA消化液輕搖幾下棄去，再加入O4mlO05％胰蛋白酶002％EDTA消化液消化，最后加入O4％臺盼藍O1ml，充分吹打使其混勻。將上述混懸液充入血細胞計數(shù)板內(nèi)，置于顯微鏡下計數(shù)活細胞，每孔計算活細胞數(shù)，生長抑制率=(空白對照活細胞數(shù)一治療組的活細胞數(shù))／空白對照活細胞數(shù)。重復10次。3TuNEL檢測細胞凋亡：采用A375細胞傳代貼壁培養(yǎng)于75cnl2細胞瓶中，在用細胞混懸液5

4、ul滴在用鉻礬明膠包被好的片子鋪勻，立即4％多聚甲醛固，固定好的細胞滴片標本，在高冷風下吹干，先用03％Tritonx100／PBS作用20min，用5pg／ml蛋白酶K作用，用4％多聚甲醛后固定，用TdT酶和生物素標記的duTP4℃孵育過夜，第二天用l％乙?；窧sA及新稀釋的l：1000鹼性磷酸孵育，用NBT／BcIP作為凋亡的顯示信號。陰性對照不加TdT酶，僅加TdT緩沖液。，，4細胞免疫組化：采用A375細胞傳代貼壁培養(yǎng)于75c