槲皮素金屬配合物抗腫瘤作用及其與DNA相互作用的機理研究.pdf

1、惡性腫瘤現(xiàn)已成為人類死亡的主要原因之一,尋找抗腫瘤藥物已經(jīng)成為藥學研究的重大課題。近年研究表明某些槲皮素金屬配合物不但抗氧化活性比槲皮素強,而且其抑制腫瘤細胞生長的作用也比槲皮素強。然而目前槲皮素金屬配合物抗腫瘤的作用機制還不清楚。它們能否誘導腫瘤細胞凋亡,其信號轉導通路,作用靶點等科學問題還有待探索研究。本課題利用生物化學、細胞生物學、藥學、計算化學等多學科交叉手段,主要研究了槲皮素金屬配合物(Mn、Co、Ni、Cu、Zn)對腫瘤細胞

2、凋亡的影響,及其與DNA結合和催化DNA斷裂作用,探討了槲皮素金屬配合物誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制及其與DNA相互作用的機理。得到了如下結論:①采用MTT法、熒光染色法、流式細胞術和免疫細胞化學方法對槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性和誘導HepG2細胞凋亡進行了研究,初步探討了槲皮素金屬配合物誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制。1)結果表明槲皮素金屬配合物(Mn、Co、Ni、Cu、Zn)對肝癌細胞HepG2、SMMC-7721和肺腺癌細胞A549的生

3、長均有明顯的抑制作用,并呈明顯的劑量和時間依賴性。其中槲皮素錳、鎳和鋅配合物對腫瘤細胞生長的抑制作用明顯強于配體槲皮素,它們作用于HepG2細胞48小時的半數(shù)抑制濃度IC50分別為20.64、14.44和10.67μmol·L-1,而槲皮素的IC50為33.69μmol·L-12)形態(tài)學觀察結果表明HepG2細胞經(jīng)槲皮素錳、鎳和鋅配合物處理后,染色質凝聚,且有明顯的凋亡小體出現(xiàn),表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物能誘導HepG2細胞凋亡。3)細

4、胞周期分析結果表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用可能是通過使細胞阻滯于G0/G1期,使細胞DNA合成速度降低,細胞周期的循環(huán)被抑制而實現(xiàn)的。對G0/G1期細胞阻滯可能是配合物誘導HepG2細胞凋亡的一個重要機制。4)免疫細胞化學檢測結果表明槲皮素錳、鎳和鋅配合物誘導HepG2細胞凋亡可能通過下調bcl-2和survivin,上調p53,引發(fā)caspase的級聯(lián)反應,從而激活caspase-3來進行的。下調sur

5、vivin和bcl-2的表達對槲皮素金屬配合物誘導HepG2細胞凋亡既起到了協(xié)同作用,又起到了互補作用。②采用紫外光譜法、熒光光譜法和粘度法研究了槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物與小牛胸腺DNA的結合方式,采用凝膠電泳法、脫水丙二醛分析和T4連接實驗較系統(tǒng)地研究了槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物對質粒pBR322DNA的催化斷裂情況。初步探討了槲皮素金屬配合物和DNA的作用方式及其對DNA的催化斷裂機理。發(fā)現(xiàn)槲皮素金屬配合物具有核酸酶類活性

6、。1)槲皮素錳、鈷、鎳和鋅配合物僅以插入方式與DNA結合,而槲皮素銅配合物與DNA的結合方式可能不止一種,除插入方式結合以外還受到靜電作用的影響。2)槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物均能有效斷裂DNA,且槲皮素銅配合物斷裂DNA的能力最強;對于槲皮素錳、鎳、銅和鋅配合物,低離子強度促進DNA裂解,高離子強度抑制DNA裂解;離子強度增大能促進槲皮素鈷配合物對DNA的斷裂,所以槲皮素金屬配合物對DNA的斷裂作用受離子強度的影響。3)如以超螺旋

7、DNA為底物,槲皮素錳、鈷、鎳、銅和鋅配合物催化斷裂DNA的反應符合準一級反應速率定律。其速率常數(shù)分別為1.18×10-4s-1、0.53×10-4s-1、0.76×10-4s-1、4.82×10-4s-1、1.68×10-4s-1。4)DNA斷裂機理實驗表明槲皮素錳、鈷、鎳和鋅配合物均能以水解途徑斷裂DNA;槲皮素銅配合物以氧化還原途徑斷裂DNA,可能與Cu(I)OOH物質有關。③引入量子化學和分子力學方法,對槲皮素金屬配合物抗腫瘤作

8、用的機制及其與DNA結合作用的機理進行了理論解釋。1)對槲皮素金屬配合物結構進行了量子化學計算,通過對其幾何構型的討論,發(fā)現(xiàn)槲皮素金屬配合物的6個配位氧原子與金屬離子形成畸形六配位八面體配合物,其配位結構是合理的;根據(jù)NBO電荷分析、前沿分子軌道分析解釋了配合物的配位特性,發(fā)現(xiàn)羥基氧的配位能力強于羰基氧。2)計算結果表明槲皮素金屬配合物的LUMO及附近未占軌道能量比DNA堿基對模型CG/GC的HOMO和NHOMO的能量低,有利于配合物接

9、受DNA堿基對上的電子,增強了配合物與DNA堿基對的π-π相互作用。槲皮素金屬配合物抗腫瘤活性及其DNA鍵合能力與其LUMO的能量和配體所帶電荷兩方面的因素有關。3)運用分子力學研究了配合物插入DNA的過程,結果表明五種槲皮素金屬配合物都可以插入到DNA堿基對之間,傾向于從小溝插入到CG/GC堿基對間。根據(jù)槲皮素金屬配合物插入DNA堿基對后的勢能值,發(fā)現(xiàn)配合物與DNA插入能力的理論計算結果與實驗結果一致。槲皮素金屬配合物與DNA結合作用