槲皮素對(duì)癌癥的防治作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本課題研究了槲皮素預(yù)防癌癥發(fā)生和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用及其機(jī)制。在槲皮素預(yù)防癌癥發(fā)生的研究方面，觀察了槲皮素對(duì)苯并芘(B[a]P)引起的小鼠肺組織病變和外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用，并通過觀察槲皮素對(duì)細(xì)胞色素P450 1A1(CYP1A1)活性的影響，探討槲皮素預(yù)防癌癥發(fā)生的作用機(jī)制。在槲皮素抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的研究方面，通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察了槲皮素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞和小鼠黑色素瘤Cloudman S91細(xì)胞增殖的抑制作用，并通過觀察

2、槲皮素對(duì)Cloudman S91細(xì)胞的p53和bc1-2基因表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，探討槲皮素抑制Cloudman S91細(xì)胞增殖的作用機(jī)制；通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察了經(jīng)腹腔內(nèi)和經(jīng)口給予槲皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用；制備了槐米提取物(extract from bud of Sophora japonica，英文縮寫為 EBSJ)；觀察和比較經(jīng)口給予槲皮素和槐米提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的治療作用以及與順

3、鉑聯(lián)合治療的效果；同時(shí)，通過觀察經(jīng)口給予槐米提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞周期和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)的影響，探討槲皮素和槐米提取物抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制。 在槲皮素預(yù)防癌癥發(fā)生的研究部分，在體外實(shí)驗(yàn)中，觀察了槲皮素對(duì)人肝L-02細(xì)胞株和人肝組織中CYP1A1活性的影響：采用MTT比色法測(cè)定槲皮素對(duì)人肝L-02細(xì)胞株的IC<,50>，以此確定槲皮

4、素的試驗(yàn)劑量范圍，用不同劑量的槲皮素分別作用于人肝微粒體和L-02細(xì)胞后，測(cè)定人肝微粒體和L-02細(xì)胞中的EROD活性，即CYP1A1活性。結(jié)果顯示：在5～20μmol/L的槲皮素濃度范圍內(nèi)，槲皮素對(duì)人肝L-02細(xì)胞株CYP1A1活性的抑制作用呈顯著的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系；在5～15μmol／L的槲皮素濃度范圍，槲皮素對(duì)人肝組織中CYP1A1活性的抑制具有劑量效應(yīng)關(guān)系。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，觀察了槲皮素對(duì)B[a]P所引起的小鼠肺組織病變和血淋巴細(xì)

5、胞DNA損傷的保護(hù)作用：槲皮素高、中、低劑量組的ICR小鼠分別以2.0、1.0、0.5 g／kg·d劑量的槲皮素灌胃，正常組和模型組用槲皮素的助溶劑1％羧甲基纖維素鈉灌胃，在灌胃一周后，除正常組以外的小鼠一次性腹腔注射100mg／kg劑量的B[a]P。灌胃90天后，取小鼠尾部靜脈血進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，通過熒光顯像的方法觀察并測(cè)量血淋巴細(xì)胞DNA損傷及拖尾長(zhǎng)度；在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織標(biāo)本切片，作病理檢查；測(cè)定小鼠肺臟微粒體中CY

6、PlAl活性。結(jié)果顯示：在單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，正常組小鼠的血淋巴細(xì)胞無拖尾現(xiàn)象，而包括槲皮素高、中、低劑量組和模型組在內(nèi)的染毒組小鼠的血淋巴細(xì)胞均有拖尾現(xiàn)象，染毒組小鼠給予不同劑量的槲皮素后，隨著槲皮素的劑量升高，平均彗星尾部長(zhǎng)度逐漸減小，DNA的損傷程度顯著減輕；光鏡檢查觀察到染毒組小鼠肺組織均出現(xiàn)不同程度肺支氣管上皮細(xì)胞病理學(xué)變化，但槲皮素組小鼠的肺組織病變程度明顯輕于模型組，說明槲皮素對(duì)B[a]P引起的血淋巴細(xì)胞DNA損傷和肺組

7、織病變過程有保護(hù)作用。此外，觀察到槲皮素在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也抑制小鼠肺微粒體中的CYPlAl活性，并呈典型的劑量效應(yīng)關(guān)系，提示其保護(hù)作用的機(jī)制可能與槲皮素抑制了CYPlAl的活性有關(guān)。 在槲皮素對(duì)癌癥的治療作用及其機(jī)制研究的體外實(shí)驗(yàn)部分，觀察了槲皮素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞和小鼠黑色素瘤CloudmanS91細(xì)胞增殖的抑制作用，并探討了槲皮素抑制CloudmanS91細(xì)胞增殖的作用機(jī)制：以不同劑量的槲皮素作用于A549和Cloudman

8、S91細(xì)胞，采用MTT試驗(yàn)觀察槲皮素對(duì)細(xì)胞增殖的影響；采用吖啶橙/溴乙錠熒光染色、流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及Western blot分析技術(shù)，觀察槲皮素誘導(dǎo)CloudmanS9l細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，并探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示：槲皮素對(duì)A549和CloudmanS91細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率呈劑量效應(yīng)關(guān)系；CloudmanS91細(xì)胞用40～120μmol/L 的槲皮素處理72h后，可見明顯的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，

9、流式細(xì)胞儀檢測(cè)有亞G<,1>峰出現(xiàn)，細(xì)胞被阻滯于G<,0>/G<,1>期；Westem blot分析提示槲皮素可抑制突變型p53基因、bcl-2基因的表達(dá)，且呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。提示槲皮素可能是通過抑制突變型p53基因以及bc1-2基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)CloudmanS91細(xì)胞的凋亡，并通過阻滯細(xì)胞于G<,0>/G<,1>期，抑制了Cloudman S91細(xì)胞的增殖。 在槲皮素對(duì)癌癥的治療作用及其機(jī)制研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，(1)

10、觀察了腹腔內(nèi)給予槲皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用：將移植有 Lewis 肺癌的ICR小鼠隨機(jī)分為模型組、槲皮素組及順鉑組，采取腹腔內(nèi)注射方式給藥。給藥結(jié)束后，測(cè)定各組小鼠的瘤重，計(jì)算抑瘤率；用免疫組化方法測(cè)定腫瘤的PCNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：腹腔內(nèi)給予槲皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并顯著地下調(diào)了小鼠Lewis肺癌移植瘤的PCNA表達(dá)水平。提示槲皮素對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤的增殖有明顯的抑制作用，其

11、機(jī)制可能與抑制PCNA蛋白的表達(dá)有關(guān)。(2)制備了槐米提取物，并建立了提取和測(cè)定槐米中槲皮素的方法。(3)觀察和比較了經(jīng)口給予槲皮素和槐米提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用以及與順鉑聯(lián)合治療的效果：以槲皮素和槐米提取物制成受試溶液，以移植了Lewis肺癌的。ICR小鼠為動(dòng)物模型，槲皮素組(高、中、低劑量組的劑量分別為4.5g／kg·d、3.0g／kg·d、1.5g／kg·d)和槐米提取物組(高、中、低劑量組的劑量分別為6.0

12、g／kg·d、4.0g／kg·d、2.0g／kg·d)以及槲皮素+順鉑組和槐米提取物+順鉑組分別在腫瘤移植前以槲皮素或槐米提取物連續(xù)灌胃10天，在腫瘤移植后繼續(xù)灌胃16天；順鉑組以及槲皮素+順鉑組和槐米提取物+順鉑組分別在腫瘤移植后隔天腹腔注射1mg／kg劑量的順鉑一次。腫瘤移植17天后測(cè)定各組小鼠體重、瘤重、脾臟及胸腺的重量，以及血常規(guī)指標(biāo)，計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果顯示：槲皮素高、中、低劑量組的抑瘤率分別為44.5％、42.

13、7％、34.3％；槐米提取物高、中、低劑量組抑瘤率分別為46.4％、43.8％、37.3％。順鉑組的抑瘤率為40.2％，而槲皮素+順鉑組和槐米提取物+順鉑組的抑瘤率分別為49.3％和55.2％。小鼠荷瘤后出現(xiàn)脾臟重量和血常規(guī)指標(biāo)的異常，經(jīng)過治療后，異常狀態(tài)有明顯改善。提示經(jīng)口給予槲皮素和槐米提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌有良好的抑瘤作用，與順鉑聯(lián)合治療的效果明顯增強(qiáng)。(4)觀察了經(jīng)口給予槐米提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤細(xì)胞周期和PCNA

14、表達(dá)的影響：在Lewis肺癌小鼠模型的移植前后，槐米提取物的高、中、低劑量組以及槐米提取物+順鉑組分別以不同劑量的槐米提取物連續(xù)灌胃共26天，順鉑組以及槐米提取物+順鉑組分別在腫瘤移植后的16天內(nèi)隔天腹腔注射1mg／kg劑量的順鉑。給藥結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布；用免疫組化方法測(cè)定PCNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：槐米提取物使小鼠Lewis肺癌移植瘤的G0／G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯減少；PCNA指數(shù)明顯降低，其作用比