槲皮素抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究.pdf

1、心腦血管疾病發(fā)生率及死亡率明顯上升,嚴重危害大眾的身體健康。積極防治心血管疾病,尋找并發(fā)現(xiàn)具有心血管保護作用的營養(yǎng)素和植物化學(xué)物,并探索其分子機制,已成為營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域研究重點之一。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),黃酮類物質(zhì)的日常攝入量與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展呈明顯負相關(guān)。槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮),又名櫟精,槲皮黃素,是一種廣泛存在于水果、蔬菜和谷物等植物中的植物源性黃酮類化合物。缺血再灌注損傷是指缺血組織再有血液供應(yīng)時,非但沒有改善細

2、胞狀態(tài),反而使組織器官功能進一步受損的現(xiàn)象。缺血再灌注損傷也是心血管疾病愈后不良及死亡的主要原因。研究表明,槲皮素可以有效對抗心肌缺血再灌注損傷,但其機制尚不清楚。
　　本研究旨在深入探討槲皮素抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的分子機制。
　　方法上采用新生SD大鼠原代心肌細胞,建立體外缺血再灌注損傷模型,即缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷模型。首先在A/R前24小時,分別以10μM、20μM、40μM、80μM槲皮素預(yù)處理,再檢測細胞

3、存活率和14-3-3η蛋白表達水平,以選擇槲皮素上調(diào)14-3-3η蛋白表達水平并發(fā)揮抗 A/R損傷保護作用的最佳劑量,然后分別在A/R前24小時、48小時、72小時,加入20μM槲皮素,以明確槲皮素上調(diào)14-3-3η蛋白水平的最佳預(yù)處理時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20μM槲皮素72小時預(yù)處理可顯著上調(diào)A/R損傷的新生SD大鼠原代心肌細胞內(nèi)14-3-3η蛋白表達水平,并同時發(fā)揮保護作用,與對照組及A/R組比較,p<001。
　　接下來,用14-3

4、-3ηRNAi腺病毒感染新生大鼠原代心肌細胞,并進行槲皮素處理,A/R損傷后檢測培養(yǎng)液CPK和LDH活性,細胞存活率、ROS含量、線粒體膜電位、mPTP開放、細胞凋亡等,與單獨槲皮皮素處理組比較以確認14-3-3η蛋白水平上調(diào)與槲皮素抗A/R損傷保護之間的關(guān)系。結(jié)果表明槲皮素抗心肌細胞A/R損傷保護作用,包括抗氧化應(yīng)激、穩(wěn)定線粒體膜電位、抑制mPTP開放和減少細胞凋亡均依賴于其對表達水平的上調(diào)。
　　14-3-3η是細胞內(nèi)重要的調(diào)

5、節(jié)蛋白,它的作用方式是與不同的靶蛋白結(jié)合,通過激活靶蛋白,改變靶蛋白構(gòu)象,或幫助靶蛋白向細胞內(nèi)特定部位遷移而實現(xiàn)其各種生物學(xué)功能。PKCε是細胞內(nèi)關(guān)鍵性的心肌保護蛋白,研究證實,在PKCε介導(dǎo)的抗缺血再灌注損傷保護作用中,涉及其從心肌細胞胞漿向線粒體的移位,但該移位是如何發(fā)生的,還不清楚。為探討14-3-3η和PKCε之間的相互作用,我們采用GST-pulldown、Co-IP及激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光雙染色等方法,結(jié)果證實,14-

6、3-3η可以與PKCε發(fā)生相互作用,免疫熒光染色結(jié)合線粒體示蹤劑的觀察結(jié)果表明,在在A/R損傷的新生大鼠原代心肌細胞,14-3-3η和PKCε都可以定位于線粒體。
　　為進一步探討14-3-3η對 PKCε介導(dǎo)的心肌抗缺血再灌注損傷保護作用的影響,我們構(gòu)建了14-3-3η高表達重組腺病毒ADeasy14-3-3η和PKCε高表達重組腺病毒ADeasyPKCε。新生大鼠原代心肌細胞分別感染ADeasyPKCε,共感染 ADeasyP

7、KCε和ADeasy14-3-3η,共感染 ADeasyPKCε和AD14-3-3ηRNAi,感染ADeasyPKCε并經(jīng)槲皮素預(yù)處理,檢測A/R損傷后的細胞存活率、CPK和LDH活性、與氧化應(yīng)激相關(guān)的細胞內(nèi)ROS及MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH-Px活性、分離線粒體后western blot測各組細胞PKCε在線粒體的分布,與線粒體細胞有關(guān)的線粒體膜電位、mPTP開放、與凋亡相關(guān)的caspase3活性和細胞凋亡百分率,以比較在PK

8、Cε高表達的情況下,比較14-3-3η低表達,外源性或槲皮素預(yù)處理引起的14-3-3η高表達對 PKCε在線粒體的分布,及其介導(dǎo)的心肌保護作用的影響。結(jié)果證實槲皮素或重組腺病毒誘導(dǎo)的14-3-3η蛋白過表達,可促進A/R損傷的新生大鼠原代心肌細胞內(nèi)PKCε從胞漿向線粒體的遷移,增強PKCε介導(dǎo)的抗A/R損傷保護作用,感染14-3-3ηRNAi腺病毒則反之。
　　綜上所述,我們證實20μM槲皮素72小時預(yù)處理可顯著上調(diào)A/R損傷的新

9、生SD大鼠原代心肌細胞內(nèi)14-3-3η蛋白表達水平,并同時發(fā)揮保護作用。槲皮素的抗心肌缺血再灌注損傷保護作用機制涉及通過上調(diào)細胞內(nèi)14-3-3η蛋白表達水平,繼而促進14-3-3η與PKCε的相互作用,增加胞漿PKCε向線粒體的遷移,增強PKCε對線粒體功能的維護,包括穩(wěn)定線粒體膜電位,抑制mPTP開放,最終減少細胞凋亡。
　　本研究揭示了槲皮素抗心肌細胞 A/R損傷保護作用的細胞內(nèi)分子機制,對槲皮素在心血管保護方面的應(yīng)用提供了新