槲皮素對酒精性肝鐵過載的保護效應及其機制研究.pdf

1、第一部分：槲皮素對酒精性肝鐵過載的保護效應
　　目的:以長期暴露酒精和/或鐵的C57BL/6J小鼠為研究對象,探討槲皮素對酒精性肝鐵過載時氧化損傷的保護效應。
　　方法:
　　1.分組:120只體重為18-20g的雄性C57BL/6J小鼠隨機分為八組:正常對照組(喂飼正常Lieber De Carli飼料)、酒精組(喂飼含酒精(30％能量)的LieberDeCarli飼料)、槲皮素對照組(100mg/kg.bw.ig.

2、)、槲皮素+酒精組、鐵組(羰基鐵w/v:0.2%)、酒精+鐵聯(lián)合組、槲皮素+鐵組、槲皮素+酒精+鐵組。
　　2.測定指標:小鼠等能量配對喂養(yǎng)15w至模型成功后,隔夜禁食,眼球取血,分離血清,根據(jù)酶動力學法測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平,ELISA方法測定血清鐵蛋白(ferritin,Ft)含量。肝臟固定后

3、用于HE染色和鐵普魯士藍染色;肝臟組織冰凍切片孵育DHE熒光探針檢測肝臟ROS水平;酶學比色法測定肝臟總膽固醇(Total Cholesterol,TC)和總甘油三酯(Total triglyceride,TG)水平;硫代巴比妥酸比色法、改良二硫代二硝基苯甲酸比色法和黃嘌呤氧化酶比色法分別測定肝臟丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismuta

4、se,SOD)的水平;實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR,qRT-PCR)和Western Blot方法分別測定肝臟中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TfR)mRNA和蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.能量配對喂養(yǎng)期間,各組小鼠日均進食能量無差異,但所有含酒精組小鼠體重輕于不含酒精組小鼠,槲皮素或鐵對小鼠體重無影響。與正常對照組比較,酒精或鐵喂養(yǎng)小鼠的肝臟體重比增加,酒精和鐵的聯(lián)合組進

5、一步增加,槲皮素可以明顯降低酒精和鐵單獨或者聯(lián)合作用增加的肝臟體重比系數(shù)。
　　2.與正常對照組相比,酒精或鐵均明顯引起肝臟脂肪變性,導致肝臟TC、TG含量及血清AST、ALT水平升高;兩者聯(lián)合染毒后脂肪泡進一步增大,肝臟TC、TG與血清AST、ALT水平進一步升高;槲皮素干預有效改善酒精和/或鐵單獨或聯(lián)合染毒時引起的肝臟脂肪變性和轉(zhuǎn)氨酶釋放。
　　3.長期酒精暴露尤其是鐵染毒后小鼠肝臟總鐵含量、血清Ft和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(t

6、ransferrin,TS)水平升高,肝臟鐵沉積明顯,GSH水平與SOD活性下降而ROS、MDA明顯升高;兩者聯(lián)合染毒后鐵過載與氧化應激程度進一步升高;槲皮素干預有效改善酒精和/或鐵單獨或聯(lián)合染毒時引起的肝臟鐵過載與氧化應激。
　　4.與正常對照組相比,長期酒精或鐵單獨暴露后小鼠肝臟TfR1mRNA水平下降,但其蛋白表達水平升高,聯(lián)合染毒時TfR1的mRNA水平進一步下降而蛋白水平進一步升高;酒精和鐵單獨或者聯(lián)合喂養(yǎng)小鼠經(jīng)槲皮素干

7、預后,TfR1表達基本恢復正常水平。與正常對照組相比,酒精對TfR2表達無明顯影響,但鐵單獨或聯(lián)合酒精染毒時均明顯增加TfR2的表達(單獨與聯(lián)合染毒時TfR2的表達水平無差異);槲皮素干預對酒精和/或鐵單獨或聯(lián)合染毒小鼠肝臟TfR2表達無明顯影響。
　　5.槲皮素對正常小鼠肝臟損傷、肝臟鐵含量和血清Ft和TS水平、氧化損傷和TfR1或TfR2表達均無明顯影響。
　　結(jié)論:槲皮素對酒精性肝鐵過載以及氧化損傷具有良好的拮抗作用,

8、其機制可能與下調(diào)TfR1的蛋白表達有關(guān)。
　　第二部分：槲皮素對酒精性肝過載時“游離”鐵水平的影響及相關(guān)機制
　　目的:本部分旨在分析慢性酒精暴露誘導小鼠鐵過載時“游離”鐵水平及其攝取與釋放分子的變化,以及槲皮素的拮抗效應及相關(guān)機制。
　　方法:
　　1.動物分組同前;
　　2.肝臟LIP測定:含EDTA勻漿介質(zhì)螯合肝臟中不穩(wěn)定鐵池(labile iron pool,LIP),經(jīng)超濾管離心后采用火焰原子吸收

9、測定儀測定;
　　3.血清NTBI測定:采用帶有熒光標記比色法的原理測定血清非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin binding iron,NTBI);
　　4.qRT-PCR和Western blot方法分別測定二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1(Two divalent metal transporter 1,DMT1)、鋅轉(zhuǎn)運成員的14(Zinc transporter member 14,ZIP14)、瞬時受體潛在粘

10、脂蛋白(transient receptor potential mucolipin 1,TRPML1)及Ft的mRNA和蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.與正常對照組比較,酒精和鐵單獨或者聯(lián)合組均升高血清NTBI水平,同時肝臟DMT1和ZIP14的表達均增加,槲皮素干預不同程度的降低酒精和鐵增加的血清NTBI水平以及肝臟DMT1和ZIP14表達;
　　2.與正常對照相比,酒精與鐵染毒后肝臟LIP-Fe水平分別增加1

11、.2倍和4.1倍,兩者聯(lián)合染毒后LIP-Fe水平更是增加6.5倍,肝臟TRPML1mRNA與蛋白表達水平也相應增加,槲皮素干預降低酒精、鐵以及聯(lián)合組的LIP-Fe水平及TRPML1的表達,而槲皮素對正常小鼠以上指標無明顯影響;
　　3.與正常對照組相比,長期酒精攝入尤其是鐵暴露明顯增加肝臟鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain,FL)的表達,但對重鏈(ferritin heavy chain,FH)無明顯影響;聯(lián)合染

12、毒后FL與FH卻相較于正常對照組均有明顯升高;槲皮素對酒精或鐵染毒所致的FL升高及兩者聯(lián)合作用下FL與FH的升高均有明顯的拮抗作用;
　　4.與正常對照組相比,槲皮素組血清NTBI與肝臟LIP-Fe水平及FH、FL表達均沒有明顯變化,肝臟DMT1、ZIP14、TRPML1和Ft表達也沒有明顯變化。
　　結(jié)論:槲皮素可拮抗酒精繼發(fā)性肝鐵過載時“游離”鐵的紊亂,可能與其調(diào)節(jié)肝細胞負責攝取血清NTBI和胞漿釋放LIP-Fe的關(guān)鍵分

13、子有關(guān),并提示內(nèi)涵體和溶酶體均是酒精性肝鐵過載LIP-Fe的來源。
　　第三部分：槲皮素對hepcidin依賴的酒精性肝鐵過載的拮抗效應:BMP6/Smad4的作用
　　目的:以長期喂飼含酒精和/或鐵的液體飼料的C57BL/6J小鼠和酒精孵育的小鼠原代肝細胞為研究對象,探討hepcidin在槲皮素改善小鼠酒精性肝鐵過載中的作用以及骨形態(tài)蛋白6(Bone morphogenetic protein 6,BMP6)/Smad家族

14、成員4(Smad family member 4,Smad4)信號通路潛在效應。
　　方法:
　　1.動物分組同前;
　　2.二步膠原酶法分離培養(yǎng)小鼠原代肝細胞,無水乙醇(100mmol/L)單獨或聯(lián)合槲皮素(Et+Qu,100μmol/L)、人重組BMP6蛋白(Et+BMP6,100ng/ml)、抗BMP6抗體(Et+anti-BMP6,25μg/ml)孵育小鼠原代肝細胞24h;
　　3.免疫組化方法測定肝臟H

15、epcidin的表達,qRT-PCR測定肝臟Hepcidin、BMP2、BMP4、BMP6、BMP9和Smad4以及小鼠原代細胞Hepcidin、BMP6和Smad4的mRNA表達水平,WesternBlot測定肝臟BMP6和Smad4以及小鼠原代肝細胞胞漿和胞核Smad4的表達;
　　4.染色質(zhì)免疫共沉淀方法測定酒精、槲皮素和BMP6抑制劑或激活劑孵育的小鼠原代肝細胞Smad4與HAMP啟動區(qū)DNA結(jié)合活性。
　　結(jié)果:<

16、br>　　1.與正常對照組相比,鐵明顯增加肝臟hepcidin表達,而酒精明顯減少hepcidin的表達,且降低鐵對hepcidin的誘導(但仍高于正常對照組);酒精和鐵單獨或者聯(lián)合喂養(yǎng)小鼠,經(jīng)槲皮素干預后肝臟hepcidin表達接近正常對照組水平;
　　2.酒精對BMP2、BMP4和BMP9的mRNA表達無明顯影響,但明顯降低BMP6及其下游蛋白Smad4的mRNA和蛋白水平,同時抑制鐵對BMP6及SMAD4的誘導,酒精和鐵單獨

17、或者聯(lián)合作用引起的BMP6和Smad4的變化,經(jīng)槲皮素干預后均趨于正常對照組水平;槲皮素對正常小鼠肝臟BMP6及Smad4的表達無明顯影響;
　　3.酒精孵育小鼠原代肝細胞降低Smad4與HAMP的DNA結(jié)合力,anti-BMP6進一步降低酒精對Smad4與HAMP的DNA結(jié)合力及hepcidinmRNA表達;人重組BMP6蛋白及槲皮素處理酒精孵育的肝細胞,均降低酒精對Smad4與HAMP的DNA結(jié)合力的抑制,增加hepcidin