槲皮素調(diào)節(jié)同型半胱氨酸代謝的作用及機(jī)制分析.pdf

1、目的:建立高同型半胱氨酸(Hcy)血癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在此基礎(chǔ)上，從代謝和基因表達(dá)等途徑的角度探討槲皮素對(duì)Hcy合成和分解的影響，尤其是槲皮素對(duì)Hcy代謝過(guò)程中重要代謝產(chǎn)物和關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的影響，最終揭示槲皮素調(diào)節(jié)Hcy代謝的分子機(jī)制，為植物化學(xué)物應(yīng)用于心血管疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.以AIN-93飼料，在此基礎(chǔ)上分別添加1％、2％和3％蛋氨酸(Met)喂養(yǎng)大鼠21天，采用高效液相色譜(HPLC)法

2、測(cè)定血清中Hcy及其相關(guān)代謝產(chǎn)物水平，氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中氨基酸含量，確定誘導(dǎo)高Hcy血癥的Met適宜劑量。
　　2.大鼠分別喂以AIN-93合成飼料或在此基礎(chǔ)上添加1％的Met以及對(duì)大鼠進(jìn)行束縛應(yīng)激，配對(duì)喂養(yǎng)6周。采用HPLC法測(cè)定血清中Hcy及半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)水平，氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中其它氨基酸含量，確定束縛應(yīng)激對(duì)Met誘導(dǎo)高Hcy血癥模型的影響。
　　3.大鼠分別給予AIN-93合成飼

3、料或在此飼料中添加1％的Met和0.1、0.5、2.5％的槲皮素(Q)喂養(yǎng)6周。采用HPLC法測(cè)定血清中Hcy、Cys和GSH水平，以及血清中槲皮素代謝產(chǎn)物濃度。氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中絲氨酸(Ser)、?；撬?Tau)、甘氨酸(Gly)、胱氨酸含量，同時(shí)檢測(cè)肝組織和血清中抗氧化指標(biāo)。最終確定槲皮素對(duì)Hcy代謝的調(diào)節(jié)作用及適宜劑量。
　　4.大鼠分別給予AIN-93合成飼料或在此飼料中添加1％的Met和0.5％的槲皮素喂養(yǎng)6周。

4、采用HPLC法測(cè)定血清中Hcy及Cys、GSH水平，氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清中氨基酸含量的變化情況，采用HPLC法測(cè)定肝組織中S-腺苷蛋氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量以及S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHH)水解活性和合成活性，采用化學(xué)方法測(cè)定胱硫醚-β-合成酶(CBS)、甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)、蛋氨酸合成酶(MS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)活性。采用Real-time PCR法測(cè)定SAHH、C

5、BS、BHMT、MS和CSE mRNA表達(dá)水平，最終揭示槲皮素調(diào)節(jié)Hcy代謝的作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:
　　1.建立了大鼠高Hcy血癥模型。
　　2.選擇含1％、2％和3％Met飼料喂飼大鼠3周，結(jié)果飼料中含1％Met可以使血清Hcy顯著水平升高且無(wú)生長(zhǎng)抑制等毒副作用，含2％和3％Met飼料喂養(yǎng)大鼠后Hcy顯著水平亦升高，同時(shí)大鼠出現(xiàn)攝食量減少和生長(zhǎng)抑制等。各高M(jìn)et飼料組大鼠血清Cys沒(méi)有明顯差異，血清GSH含量雖然高

6、于對(duì)照組，但也沒(méi)有顯著差異。
　　3.1％ Met組大鼠血清Hcy水平隨著大鼠束縛時(shí)間延長(zhǎng)不斷增高，在第六周時(shí)明顯高于其它各組。而束縛組和束縛+1％ Met組隨著時(shí)間延長(zhǎng)而Hcy水平降低，在第四周和第六周時(shí)顯著低于對(duì)照組和1％ Met組。大鼠血清Cys水平束縛組和束縛+1％ Met組顯著低于對(duì)照組和1％ Met組。血清GSH含量在第六周時(shí)束縛組顯著低于其它各組。
　　4.與正常對(duì)照比較，束縛組蘇氨酸(Thr)、Ser、Gly

7、、谷氨酸(Glu)、胱氨酸、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)含量顯著降低，而Met和Tau則顯著升高。
　　5.血清中槲皮素和異鼠李素含量隨飼料中槲皮素含量的增加而顯著增加。血清Met和Hcy隨著槲皮素含量增加降低，1％Met+0.5％Q組Hcy含量顯著低于1％Met組，對(duì)照組血清胱氨酸和Tau含量最低，且顯著低于1％Met組。槲皮素干預(yù)組血清GSH含量隨著槲皮素含量的增加下降，且1％Met

8、+2.5％Q組與1％Met組有顯著差異。Met與槲皮素干預(yù)組血清Ser含量低于對(duì)照組，且1％Met+2.5％Q組與對(duì)照組有顯著差異。
　　6.1％Met+0.5％Q組丙二醛(MDA)含量明顯低于對(duì)照組、1％Met和1％Met+2.5％Q組，而對(duì)照組和1％Met組GSH含量明顯高于1％Met+0.1％Q、1％Met+0.5％Q和1％Met+2.5％Q組,1％Met+2.5％Q組超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著低于正常對(duì)照組和1％Me

9、t組。FRAP和蛋白質(zhì)羰基化物各組間沒(méi)有明顯差異。
　　7.1％Met+2.5％Q組丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性明顯高于其它各組，提示2.5％槲皮素可能對(duì)肝臟產(chǎn)生一定毒性。
　　8.與對(duì)照組和1％Met比較，1％Met+0.5％Q組SAM顯著升高，0.5％Q組SAM含量亦高于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1％Met+0.5％Q組SAH較對(duì)照組和槲皮素單獨(dú)干預(yù)組顯著升高，1％Met組SAM/SAH顯著降低。而

10、0.5％Q組和Met+0.5％Q組SAM/SAH升高。1％Met、0.5％Q和1％Met+0.5％Q組SAHH合成酶活性較對(duì)照組顯著升高，0.5％Q和1％Met+0.5％Q組SAHH水解酶活性較對(duì)照組顯著升高。1％Met及1％Met+0.5％Q組與對(duì)照組和0.5％Q組比較，SAHH mRNA基因表達(dá)明顯上調(diào)，0.5％Q組SAHH mRNA基因表達(dá)亦上調(diào)較對(duì)照組，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　9.1％Met+0.5％Q組BHMT活性較對(duì)照

11、組顯著升高，且MS活性顯著高于其它各組。BHMT mRNA表達(dá)各組間無(wú)顯著差異，與對(duì)照組和0.5％Q組比較，1％Met及1％Met+0.5％Q組MS mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，各干預(yù)組CBS酶活性較對(duì)照組顯著升高，且1％Met+0.5％Q組CBS活性顯著高于0.5％Q組，與對(duì)照組比較，各干預(yù)組CBS mRNA表達(dá)上調(diào)，1％Met+0.5％Q組CBS酶mRNA表達(dá)較其它各組亦顯著上調(diào)。與對(duì)照組比較，各干預(yù)組CSE活性均顯著增加，且各干預(yù)組CS

12、E mRNA表達(dá)較對(duì)照組亦顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.1％Met可以成功誘導(dǎo)大鼠高Hcy血癥模型。
　　2.長(zhǎng)時(shí)間束縛應(yīng)激可降低血清中Hcy水平，且對(duì)氨基酸代謝產(chǎn)生影響。
　　3.高劑量槲皮素對(duì)肝組織不但不具有抗氧化作用，還可能促氧化，對(duì)肝組織產(chǎn)生一定毒性。適宜劑量的槲皮素不僅具有抗氧化作用，而且可以明顯降低血清中Hcy水平。
　　4.槲皮素主要影響Hcy代謝過(guò)程中的轉(zhuǎn)硫化途徑，通過(guò)提高CBS、CSE活