甲狀腺激素對內皮細胞凋亡的影響及OPG干預研究.pdf

1、背景: 心血管疾病已成為危害人類健康的第一殺手，動脈粥樣硬化是心血管事件發(fā)病的共同基礎。甲狀腺功能異?？芍苯踊蜷g接導致動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期病理生理改變。血管內皮完整性及內分泌功能是維持血管內皮功能正常的重要基礎，因此血管內皮細胞凋亡增加是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制。甲狀腺功能異?；颊吆喜⒀軆绕すδ苷系K，是其高于同性別、同年齡正常人群的心血管事件發(fā)生率的重要原因，而早期血管內皮功能障礙是可以逆轉

2、的，因此早期診斷、早期治療甲狀腺疾病患者血管內皮功能障礙顯得十分重要。然而，在甲狀腺功能異常狀態(tài)下動脈粥樣硬化的發(fā)生，尤其是血管內皮功能受損的機制目前仍然不清楚。
　　 護骨素（OPG）是一種分泌型糖蛋白，可抑制破骨細胞分化和功能，增高骨密度。近來發(fā)現(xiàn)它是一種重要的血管調節(jié)因子。甲狀腺功能異?；颊咄檠錙PG水平升高，但是OPG在甲狀腺功能異常狀態(tài)下對血管內皮功能的具體的作用及機制目前尚不清楚。
　　 核因子κ B是

3、重要的轉錄調節(jié)因子，廣泛參與許多病理生理反應。IκB激酶(IKK)是核因子KB激活的關建酶。IKK由3個亞基組成，IKKα、IKKβ和IKKγ，而IKK活性主要表現(xiàn)為IKKβ。IKKβ能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)重要的上游蛋白TSC1活性。mTOR作為很多信號通路的下游，在調節(jié)細胞營養(yǎng)和能量代謝、蛋白質合成、細胞生長與凋亡中發(fā)揮重要作用，mTOR主要通過調節(jié)核糖體S6蛋白激酶(S6K)和真核細胞始動因子4E結合蛋白1(4EB

4、P1)活性來發(fā)揮作用，而OPG對甲狀腺功能異常狀態(tài)下，血管內皮細胞凋亡及核因子κB，mTOR作用及機制目前缺乏相關研究證據。
　　 為此，本課題假設:甲狀腺功能異常狀態(tài)引起血管內皮細胞凋亡增加，OPG通過抑制IKKβ/mTOR信號通路，對血管內皮細胞具有保護作用。
　　 目的:本研究通過不同濃度甲狀腺激素干預人臍靜脈內皮細胞，探討OPG對不同甲狀腺功能狀態(tài)下人臍靜脈內皮細胞的作用及其機制，旨在為OPG在未來治療及預防甲狀

5、腺功能異常患者血管病變及動脈粥樣硬化等方面的應用研究提供實驗依據。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng):入臍靜脈內皮細胞株用含10％小牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞常規(guī)在37℃、5％ CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱中生長。
　　 2.MTT試驗:MTT法檢測不同濃度甲狀腺激素（0、0.1、1、10、50、100nmol/L，T3）在不同時間(24h、48h、72h)對人臍靜脈內皮細胞活性影響，為后續(xù)實驗探討最佳

6、時間點。
　　 3.細胞凋亡檢測:Hoechst33258與流式細胞檢測不同濃度甲狀腺激素下(0、0.1、1、10、50、100nmol/L，T3)對人臍靜脈內皮細胞凋亡影響，為后續(xù)實驗探討最佳低濃度與高濃度甲狀腺激素。
　　 4.實驗分組:將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)分組:對照組(0nmol/L，T3)、對照組(0nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)、低濃度組(0.1nmol/L，T3)、低濃度組(0.

7、1nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)、生理濃度組(1nmol/L，T3)、生理濃度組（1nmol/L，T3）+OPG(100ng/ml)、高濃度組(10nmol/L，T3)、高濃度組(10nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)下培養(yǎng)48h。Hoechst33258和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　 5.Western blot分析各組細胞磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶β(p-IKKβ)、NF-κ B抑制蛋

8、白激酶β(IKKβ)、磷酸化結節(jié)性硬化復合物1(p-TSC1)、結節(jié)性硬化復合物1(TSC1)、磷酸化核糖體蛋白S6激酶(p-S6K)、核糖體蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、Bcl-2及Bax表達水平。
　　 6.統(tǒng)計分析:所有數(shù)據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，MTT數(shù)值采用析因設計資料的方差分析。Hoechst33258染色與流式細胞術

9、檢測結果比較采用單變量方差分析(One-Way ANOVA)，SNK法;干預組與未干預組比較用兩個樣本獨立t檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.細胞形態(tài):倒置相差顯微鏡下，可見部分細胞貼壁，伸出偽足;細胞完全貼壁時，呈圓形、短梭形或扁平多角形，且單層排列;3～4d呈魚貫狀相連;5～6d細胞生長緩慢，達到其生長高峰，處于生長平臺期。
　　 2.細胞生長活性(MTT):不同濃度組間有顯著差異(F

10、=299.27，P=0.000)，其中生理濃度(1nmol/L)下細胞活性均高于其他濃度;不同時間組之間有顯著差異(F=1237.19，P=0.000)，生理濃度（1 nmol/L T3）在不同時間點對HUVEC保護作用最佳。細胞生長活性隨著干預時間延長而減弱，選取48h作為后續(xù)實驗干預時間點。
　　 3.細胞凋亡檢測:(1) Hoechst33258染色:生理濃度（1nmol/L）時，細胞凋亡率(13.67％±1.85％)最低

11、，各組細胞凋亡率為48.22％±1.06％（0nmol/L，T3），34.13％±0.85％(0.1 nmol/L,T3),31.32％±2.51％(10 nmol/L,T3),62.74％±3.40％(50 nmol/L，T3)，82.47％±6.37％(100 nmol/L，T3)，各組與生理濃度組相比，細胞凋亡率差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。(2) Annexin V-FITC/PI雙染法:0、0.1、10nmol/L組與

12、生理濃度組早期凋亡率分別為28.24％±7.57％，29.92％±6.07％，26.13％±2.28％，8.57％±154％;而總凋亡率為44.90％±6.34％，38.95％±7.78％，31.86％±1.06％，13.52％±1.66％，0、0.1、10nmol/L組與生理濃度組相比，早期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P＜0.05);而50、100nmol/L組和生理濃度組中晚期凋亡率為59.19％±5.86％，75.45％±

13、7.39％，4.95％±1.26％，總凋亡率為67.04％±5.93％，84.66％±6.40％，13.52％±1.66％，而50、100nmol/L組與生理濃度相比，中晚期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P＜0.05)。(3) Hoechst33258染色觀察OPG對不同濃度甲狀腺激素下人臍靜脈內皮細胞凋亡的形態(tài)學變化:對照組，低濃度組，生理濃度組，高濃度組細胞凋亡率分另為49.27％±4.80％，36.11％±2.57％，18.

14、43％±4.91％，35.91％±1.86％，OPG干預后，各組細胞凋亡率分別為24.47％±2.16％，15.97％±0.87％，16.16％±2.33％，24.05％±3.04％，對照組、低濃度組、高濃度組細胞干預前后細胞凋亡率具有明顯差異，P值分別為0.044，0.040，0.043;生理濃度組OPG干預前后細胞凋亡率無明顯差異(P=0.59)。(4) Annexin V-FITC/PI雙染法檢測OPG對不同濃度甲狀腺激素下人臍靜

15、脈內皮細胞凋亡的影響:對照組，低濃度組，高濃度組早期凋亡率分別為35.33％±2.51％，28.63％±0.68％，27.09％±3.29％，OPG干預后，各組早期凋亡率分別為19.51％±1.33％，11.05％±4.00％，18.40％±7.67％，各組OPG干預前后早期凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.035，0.048，0.019;對照組，低濃度組，高濃度組總凋亡率分別為47.97％±5.11％，39.79％±0.88％，

16、35.14％±2.58％;OPG干預后，各組總凋亡率分別為30.68％±1.97％，19.30％±3.63％，24.64％±8.78％，各組OPG干預前后總凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.048，0.028，0.045。生理濃度組早期細胞凋亡率和總凋亡率分別為12.80％±2.62％，16.55％±2.36％，經OPG干預后，分別為11.98％±2.71％和17.97％±1.55％，干預前后早期細胞凋亡率和總凋亡率無明顯差異，P

17、值分別為0.885，0.206。
　　 4.IKKβ/mTOR通路:與生理濃度組相比，對照組、低濃度組和高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax表達顯著增高（均p＜0.05），p-AKT、Bcl-2表達顯著降低(均p＜0.05);經OPG干預后，對照組、低濃度組、高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax分別低于以上未干預組(均p＜0.05)，而p-AKT、Bcl-2表達高于未干預組(均p＜0.05);

18、生理濃度組OPG干預前后p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、p-AKT、Bcl-2、Bax表達無明顯差異（均P＞0.05）;低濃度組與高濃度組經rapamycin或BMS345541干預后，p-AKT、Bcl-2表達增高（均P＜0.05），Bax表達降低(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.生理濃度甲狀腺激素對人臍靜脈內皮細胞保護作用最大。
　　 2.OPG對低、高濃度甲狀腺激素下人臍靜脈上皮細胞具有保