DPP4抑制劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病是一種慢性代謝性疾病，流行范圍廣泛，對(duì)生命健康影響很大。2型糖尿病是心血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素之一，糖尿病如果控制不良會(huì)導(dǎo)致冠心病、視網(wǎng)膜眼底病變、腎臟血管病、糖尿病足等病癥。超過(guò)一半的2型糖尿病患者最終因?yàn)轭净夹募」Ｋ馈⒅酗L(fēng)等心血管并發(fā)癥而死亡。動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、細(xì)胞凋亡等在糖尿病性心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，在血管內(nèi)膜發(fā)生破壞早期便可以檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　DPP4（d

2、ipeptidyl peptidase-4，二肽基肽酶4）抑制劑是一類口服降糖藥物，具有降低血糖效果明顯、致低血糖發(fā)生率低、不引起體重增加等優(yōu)點(diǎn)，被用于糖尿病治療中。近期研究發(fā)現(xiàn)，DPP4抑制劑除了降糖作用之外，尚具有心血管保護(hù)功能，能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、增強(qiáng)內(nèi)皮eNOS磷酸化水平和減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小。DPP4抑制劑甚至能夠改善心衰的嚴(yán)重程度。但是，目前對(duì)DPP4抑制劑在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用及其分子學(xué)機(jī)制尚不可知。AMPK

3、(AMP-activated protein kinase，AMP依賴性的蛋白激酶)是生物體內(nèi)一種重要的細(xì)胞能量和應(yīng)激的感受分子，是細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)的重要調(diào)節(jié)體。既往研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的激活與心血管代謝性疾病密切相關(guān)。在HUVEC細(xì)胞中，AMPK的磷酸化激活可以顯著的改善氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，血管AMPK的失調(diào)與血管病密切相關(guān)，AMPK的調(diào)節(jié)在心血管代謝性疾病和細(xì)胞凋亡中具有重要的作用。
　　在本研究中，試圖揭示DPP4抑制劑在

4、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用，探索AMPK在該調(diào)控過(guò)程中的角色，并對(duì)其可能分子學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：
　　1.DPP4抑制劑對(duì)ROS（relative oxygen species，活性氧）、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡的影響
　　將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為三組，分別為空白對(duì)照組、高糖刺激組、DPP4抑制劑組。高糖刺激組加入葡萄糖(33 mM)，DPP4抑制劑組加入西格列?。?μM），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，利用流式細(xì)胞

5、儀檢測(cè)技術(shù)對(duì)活內(nèi)皮細(xì)胞的ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。選用H2DCFDA熒光探針作為標(biāo)記物檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS，采用JC-1熒光探針對(duì)線粒體膜電位水平進(jìn)行檢測(cè)，選用AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記熒光素探針對(duì)活細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.DPP4抑制劑對(duì)AMPK活化的影響
　　A:檢測(cè)西格列汀隨時(shí)間增加對(duì)AMPK磷酸化的影響。在內(nèi)皮細(xì)胞中加入西格列汀(1μM)，分別培養(yǎng)30 min、1h、2h、4h，

6、并且設(shè)置AMPK激動(dòng)劑AICAR（100μM）培養(yǎng)30 min作為陽(yáng)性對(duì)照。采用western blot技術(shù)檢測(cè)AMPK的磷酸化水平程度。
　　B:檢測(cè)AMPK抑制劑compound C對(duì)DPP4介導(dǎo)的AMPK磷酸化的作用。分為空白對(duì)照組、西格列汀組、AMPK抑制劑組、compound C對(duì)照組。西格列汀組加入西格列?。?μM）、AMPK抑制劑組加入西格列?。?μM）和compound C（10μM）、compound C對(duì)照組加

7、入compound C(10μM)，培養(yǎng)2h，采用western blot技術(shù)檢測(cè)AMPK的磷酸化水平程度。
　　3.AMPK在DPP4抑制劑調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用
　　將內(nèi)皮細(xì)胞分為空白對(duì)照組、高糖刺激組、DPP4抑制劑組、AMPK抑制劑組、AMPK激動(dòng)劑組。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)，分別檢測(cè)各處理ROS、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.給予內(nèi)皮細(xì)胞高葡萄糖刺激，可以引起細(xì)胞ROS水平升高，線

8、粒體膜電位破壞、細(xì)胞凋亡增強(qiáng);
　　2.在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中加入DPP4抑制劑西格列汀可以降低細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平，改善線粒體膜電位破壞，有效的降低細(xì)胞凋亡比率;
　　3.西格列汀可以增強(qiáng)AMPK的磷酸化，從30min開(kāi)始，持續(xù)增強(qiáng)到2h。AMPK抑制劑compound C可以有效的減弱西格列汀介導(dǎo)產(chǎn)生的AMPK磷酸化;
　　4.AMPK抑制劑compoundC可以逆轉(zhuǎn)高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，西格列汀介導(dǎo)的內(nèi)皮ROS水平

9、降低、線粒體膜電位破壞改善和細(xì)胞凋亡減輕的益處。AMPK激動(dòng)劑AICAR表現(xiàn)出與西格列汀相同的降低ROS水平、改善線粒體膜電位破壞和減弱內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。
　　結(jié)論：
　　1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DPP4抑制劑西格列汀可以有效的減弱高糖刺激引起的ROS水平升高、線粒體膜電位破壞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;
　　2.研究揭示了一種新穎的機(jī)制，DPP4抑制劑西格列汀在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的保護(hù)作用是通過(guò)激活A(yù)MPKα活化而發(fā)揮作用的，這為西