Notch抑制劑對內(nèi)皮細胞促進造血干細胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　通過體外直接接觸共培養(yǎng)C57小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(MEC)與GFP小鼠造血干細胞(HSC)，并在共培養(yǎng)體系中加入Notch抑制劑DAPT，在第4天檢測Notch分子的表達，研究MEC促進HSC增殖的分子機制及Notch抑制劑對肺MEC促進HSC增殖的作用，初步探討Notch信號通路對HSC的影響，為體外擴增HSC提供新的方向和為血液系統(tǒng)疾病尋找潛在的治療靶點。
　　方法：
　?、貱57小鼠肺組織經(jīng)過Ⅰ型膠原

2、酶消化獲得MEC，通過免疫熒光及流式細胞術檢測其CD31、CD34、CD45、vWF表達情況，連續(xù)8天觀察P1代MEC生長情況，每天消化3孔用于細胞的計數(shù)并繪制MEC的生長曲線。
　?、诓扇icoll密度梯度離心法從GFP小鼠的骨髓分離得到單個核細胞(MNCs)，然后利用miniMACS磁珠分選儀分選得到CD117+細胞，利用流式細胞術檢測HSC含量及HSC CD34CD117共表達率。
　?、垠w外直接接觸共培養(yǎng)骨髓CD1

3、17+細胞與P1代的MEC，并在培養(yǎng)體系中加入DAPT，分組為：HSC組、HSC+EC組、HSC+EC+DAPT組、HSC+DAPT組，每組3個復孔。培養(yǎng)至第4天收集造血干細胞樣本。根據(jù)我們前期試驗發(fā)現(xiàn)，第4天時共培養(yǎng)組HSC數(shù)量與單獨組比值變化最明顯，故我們提取第4天HSC的RNA含量并進行后續(xù)qRT-PCR試驗。
　?、軝z測Notch分子的表達：第4天時收集每組三個復孔的HSC并計數(shù);通過離心柱法提取各組HSC的總RNA，檢測

4、RNA的A260/280比值并計算RNA含量;實時熒光定量PCR法檢測各組HSC的Notch1、Notch2、Hes1的mRNA的表達，2-△△Ct分析法用于分析其相對表達量（RQ值）。
　　結果：
　　1、原代MEC的形態(tài)學及免疫表型特點：①形態(tài)學：24h大部分貼壁生長的細胞呈圓形，少數(shù)呈短梭形、不規(guī)則形，第4d細胞形圓，大小均一，可見部分相鄰細胞連接生長，形成條索樣結構;培養(yǎng)第6d細胞增多，可見出芽生長;8d細胞繼續(xù)增多

5、，細胞伸長、變細，彼此相互接觸;第10d變成圓形或卵圓形，單層排列生長;第14d時細胞融合至80％-90％左右，細胞呈多角形、卵圓形或三角形，排列在同一平面，呈典型“鋪路石”外觀;培養(yǎng)第4-7天為P1代MEC對數(shù)生長期，之后生長變緩，進入平臺期;②免疫表型：CD31抗體免疫熒光檢測陽性率為54.5％。FACS檢測其vWF、CD34、CD31、CD45表達率分別為：81.39％、57.48％、45.8％、0.17％。
　　2、免疫磁

6、珠分選后獲得的CD117+細胞采用0.4％臺盼藍染色，計算細胞活率為97％。熒光顯微鏡下細胞體積偏小，形圓，大小均等，發(fā)綠色熒光。CD117+HSC純度為99.51％，CD117CD34共表達率為75.85％。
　　3、4天時各組HSC增殖的情況：①細胞計數(shù)（x105個）：HSC+EC組(3.9±0.451)高于HSC組(2.463±0.193);HSC+EC+DAPT組(2.473±0.11)較HSC+EC組(3.9±0.451

7、)減少;P＜0.05;HSC+DAPT組(2.317±0.17)較HSC組(2.463±0.193)減少，P＞0.05;HSC+DAPT組(2.317±0.17)較HSC+EC+DAPT組(2.473±0.11)減少，P＞0.05;②各組HSC的RNA含量：HSC+EC組(2198.467±103.359)高于HSC組(1310.853±110.140);HSC+EC+DAPT組(1453.693±101.125)較HSC+EC組(21

8、98.467±103.359)減少;P＜0.05;HSC+DAPT組(1301.48±102.699)較HSC組(1310.853±110.140)減少，P＞0.05;HSC+DAPT組(1301.48±102.699)較HSC+EC+DAPT組(1453.693±101.125)減少，P＞0.05。
　　4、熒光定量PCR法檢測HSC的Notch1、Notch2、Hes1的mRNA相對表達量即RQ值：(1)Notch1：HSC+

9、EC組(1.924±0.088)高于HSC組(1.01±0.177);HSC+EC+DAPT組(1.033±0.049)較HSC+EC組(1.924±0.088)降低;P值均＜0.05;HSC+DAPT組與HSC組、HSC+EC+DAPT組相比無統(tǒng)計學差異，P＞0.05;(2)Notch2：HSC+EC組(1.479±0.063)高于HSC組(1.003±0.096);HSC+EC+DAPT組(0.919±0.291)較HSC+EC組（

10、（1.479±0.063)降低;P值均＜0.05;HSC+DAPT組與HSC組、HSC+EC+DAPT組相比無統(tǒng)計學差異，P＞0.05;(3)Hes1：HSC+EC組(2.291±0.372)高于HSC組(1.001±0.063);HSC+EC+DAPT組(1.267±0.219)較HSC+EC組(2.291±0.372)降低;P值均＜0.05;HSC+DAPT組(0.899±0.186)較HSC組(1.001±0.063)降低，P＞0