miR--31抑制血管緊張素2誘導的內(nèi)皮細胞凋亡的作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　高血壓作為心血管系統(tǒng)最常見病癥之一，影響全球患者多達10億。盡管醫(yī)療水平不斷提高，但目前中國高血壓疾病發(fā)病率較高，病情知曉率、疾病治療率及血壓控制率仍較低。血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，ECs)作為血壓升高后最直接影響的被膜細胞，其功能異常會導致炎癥介質(zhì)和促凝因子釋放，遷移能力下降，引起血管舒張功能障礙，最終導致心臟、腦、腎臟、眼以及大小血管等不同部位嚴重的并發(fā)癥。目前ECs、腎素-血管緊張素-醛固

2、酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)等因素均被認為與高血壓發(fā)病機制相關。其中血管緊張素2(AngiotensionⅡ，AngⅡ)作為RAAS中最重要的血管活性物質(zhì)。不僅可引起機體血流動力學改變，導致高血壓的發(fā)生，而且對血管內(nèi)皮功能起著非常重要的作用。因此對高血壓造成內(nèi)皮細胞損傷的機制研究就顯得尤為重要。
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)作為一種內(nèi)源性的非編碼RNA

3、，能夠與靶向mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'untranslation region，3'UTR)結合，使其翻譯過程阻斷或引起靶mRNA的降解。近年來已有大量文獻報道了miRNA可通過影響細胞的凋亡、增殖、代謝、分化等生物學過程，參與調(diào)節(jié)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-31在心肌纖維化，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉化，以及心肌缺血/再灌注損傷具有調(diào)節(jié)作用。然而miR-

4、31在高血壓疾病中內(nèi)皮功能障礙的作用和機制尚未闡明。
　　本研究旨在探究miR-31在高血壓發(fā)病過程中對內(nèi)皮細胞功能的影響及機制。
　　方法:
　　1.通過酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs);通過AngⅡ（1μmol/L）誘導HUVECs建立內(nèi)皮細胞損傷模型，對內(nèi)皮細胞生物學功能進行檢測，包括流式細胞儀檢測細胞凋亡、western

5、blot檢測凋亡相關蛋白的表達水平，CCK8法檢測細胞生長活力;通過實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測miRNA的表達。
　　2.利用miR-31模擬物/抑制物分別轉染HUVECs，并通過qRT-PCR鑒定轉染效率;CCK-8法檢測生長活力變化;流式細胞儀檢測細胞凋亡變化;平板劃痕實驗檢測細胞遷移能力變化。
　　3.生物信息學

6、預測軟件檢索miR-31的潛在靶基因，分析miR-31與潛在靶基因3'UTR的結合位點;在293T細胞中共轉染已構建的螢火蟲熒光素酶表達載體，通過熒光素酶報告基因實驗和western blot驗證miR-31與靶基因的調(diào)控關系;通過拯救實驗，明確miR-31與靶基因在AngⅡ誘導的HUVECs損傷中的機制。
　　結果:
　　1.AngⅡ刺激HUVECs后，CCK8結果顯示內(nèi)皮細胞生長活力明顯降低(P＜0.01);流式細胞術結

7、果確定細胞凋亡率明顯增加(P＜0.01);western blot結果顯示凋亡相關蛋白Caspase-3表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)。qRT-PCR結果顯示AngⅡ刺激后，miR-126、miR-200和miR-221無明顯變化(P＞0.05);miR-155表達明顯上調(diào)(P＜0.01);miR-31、miR-384和miR-590表達明顯下調(diào)(P＜0.01)。其中miR-31在AngⅡ刺激不同時間(12h、24h、36h和48h)后均

8、表達降低(P＜0.01)，其中24h變化最明顯。
　　2.轉染后，CCK-8檢測結果表明過表達miR-31的細胞生長活力明顯增加(P＜0.01)，而敲低miR-31的細胞生長活力明顯減弱(P＜0.01);流式細胞術結果顯示過表達miR-31的細胞凋亡率減少(P＜0.01)，而敲低miR-31的細胞凋亡率增加(P＜0.01);細胞劃痕實驗結果顯示過表達miR-31的細胞遷移能力增強，而敲低miR-31的細胞遷移能力減弱。
　　

9、3.生物信息學軟件分析結果顯示RASA1基因的3'UTR上存在miR-31的潛在結合位點;雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-31顯著降低含RASA1基因3'UTR序列的熒光素酶活性(P＜0.01);western blot結果發(fā)現(xiàn)過表達miR-31能夠顯著抑制RASA1的蛋白表達(P＜0.01);拯救實驗結果證實過表達miR-31對AngⅡ誘導HUVECs凋亡的保護是通過抑制RASA1表達實現(xiàn)的。
　　結論: