反式脂肪酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷和凋亡作用機制的研究.pdf

1、反式脂肪酸(trans fatty acid，TFA)是加工油脂類或含油脂類的加工食品中常見的一種組成成分，有很多研究都報道了TFA與心血管疾病存在密切關(guān)系，但TFA對心血管的作用機制仍不清楚。內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(AS)及其他許多心血管疾病的始動環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細胞損傷在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中占有重要地位。另外，內(nèi)皮細胞凋亡過度是內(nèi)皮細胞損傷初始環(huán)節(jié)，在動脈粥樣硬化的早期扮演了重要角色。
　　 目前在國內(nèi)外針對TFA對動脈粥樣

2、硬化和心血管疾病的研究主要集中在內(nèi)皮細胞損傷和內(nèi)皮細胞凋亡兩個方面，并且國外大部分研究主要以反式脂肪酸的混合物為主體對冠心病及動脈血管功能作用進行研究，很少分別研究不同飽和度trans-18:1，trans-18:2對心血管疾病和動脈血管功能的影響。鑒于我國居民膳食中TFA含量呈逐年增高的趨勢，而我國對TFA與人體健康關(guān)系的研究甚少，本課題針對不同飽和度trans-18:1，trans-18:2研究其與動脈粥樣硬化和心血管疾病的關(guān)系，通

3、過內(nèi)皮細胞損傷和凋亡兩個途徑來研究TFA對內(nèi)皮細胞的作用機制，為研究TFA對血管壁細胞的影響及其與動脈粥樣硬化的關(guān)系提供理論依據(jù)，為我國心血管疾病的預(yù)防提供科學(xué)數(shù)據(jù)，具有重要的理論和社會價值。
　　 本實驗采用MTT法檢測TFA對內(nèi)皮細胞存活率的影響，初步確定TFA對內(nèi)皮細胞損傷；通過檢測NO、NOS、MDA、SOD等相關(guān)損傷指標(biāo)的變化，觀察兩種不同飽和度的TFA對內(nèi)皮細胞造成損傷的變化；通過Western-blot和RT-PC

4、R檢測VCAM-1、ICAM-1、eNOS、iNOS等相關(guān)蛋白和mRNA表達的變化，定量檢測TFA對內(nèi)皮細胞的損傷作用；采用流式細胞儀檢測TFA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的比例，用激光共聚焦顯微鏡結(jié)合熒光染色，觀察TFA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，最后通過檢測參與死亡受體通路和線粒體通路的的酶Caspase-3、-8、-9等，綜合探討TFA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的機制。具體結(jié)果如下：
　　 1.9t C18:1和9t，12t C18:2兩種不

5、同飽和度的TFA均能抑制HUVEC的存活率，并使細胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈現(xiàn)典型的損傷狀態(tài)；
　　 2.TFA能使細胞損傷的典型指標(biāo)LDH滲出量增加，降低細胞的SOD活力，使細胞的清除自由基的能力減弱，進而使細胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量增加。形態(tài)和生化指標(biāo)表明TFA造成內(nèi)皮細胞損傷；
　　 3.LNAME與TFA聯(lián)合處理內(nèi)皮細胞比對照組和TFA單獨處理組細胞存活率都顯著下降，而SNP與TFA聯(lián)合處理內(nèi)皮細胞比對照組和T

6、FA單獨處理組細胞存活率顯著升高；TFA可誘導(dǎo)NO分泌水平、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性和mRNA表達顯著下降，而對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性和mRNA表達無顯著改變。表明TFA通過抑制eNOS活性減少NO的分泌，可能是TFA誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷的作用機制之一；
　　 4.通過RT-PCR技術(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)9t C18:1和9t，12t C18:2均能顯著上調(diào)黏附因子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的

7、mRNA的表達，說明TFA能夠通過黏附因子基因的表達誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷；
　　 5.通過流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡，我們觀察到9t C18:1和9t，12tC18:2能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。在凋亡過程中，Caspase-8、-9、-3、Bid的活性和mRNA表達都能夠被激活和上調(diào)。Caspase-8抑制劑(z-IETD-fmk)和Caspase-9抑制劑(z-LEHD-fmk)都能夠完全抑制Caspase-3的活性，并且Caspa

8、se-8抑制劑(z-IETD-fmk)同樣能夠抑制Caspase-9的活性。這說明TFA首先激活死亡受體通路的上游酶Caspase-8，然后通過Bid蛋白激活線粒體通路，激活Caspase-9并進而激活Caspase-3而誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。本研究為研究9t C18:1誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的機制提供了詳實的科學(xué)數(shù)據(jù)，為研究TFA導(dǎo)致動脈粥樣硬化的機理提供了一定的理論基礎(chǔ)；
　　 綜合上述結(jié)果，表明TFA能夠通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)控內(nèi)皮