油葵中綠原酸和咖啡酸的提取及對(duì)oxLDL誘導(dǎo)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)和咖啡酸(Caffeic acid,CA)是油葵中主要的酚酸化合物,近年研究表明,CGA和CA具有抗氧化、清除自由基、抑制突變和抗腫瘤等多種獨(dú)特的生理功能.目前,國(guó)內(nèi)油葵中CGA和CA的研究和開發(fā)還是空白.因此該研究對(duì)油葵資源的綜合利用和開發(fā)具有重要的意義.該論文主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:確定了一種同時(shí)測(cè)定油葵中CGA和CA的反相高效液相色譜(RP-HPLC)方法:采用ALLTIMA C<,18

2、>柱(250mm×4.6mm ID,5μm),流動(dòng)相為乙腈-2％乙酸溶液(15:85,v/v),流速為1.0mL/min,采用SPD-6AV紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)327nm;CGA和CA在18min內(nèi)得到很好的分離.在0.05~0.35mg.L<'-1>的線性范圍內(nèi),測(cè)定結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r≥0.997).測(cè)定的精密度為1.25％~1.46％,加標(biāo)回收率為89.22％~95.29％.同時(shí)還測(cè)定了中國(guó)具有代表性的4種油用型和4種食用型向

3、日葵中CGA和CA的含量.研究和比較了三種不同的CGA和CA提取方法:(1)水溶液提取.在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L<,9>(3<,4>)正交實(shí)驗(yàn)確定了水溶液提取CGA和CA的適宜工藝參數(shù).結(jié)果表明:浸提溫度60℃、浸提1.5h、浸提兩次、固液比為1:30.(2)甲醇溶液提取.結(jié)果表明:浸提溫度60℃、浸提時(shí)間1.5h;甲醇含量70％、固液比為1:30時(shí)CGA的提取率最高.(3)超臨界CO<,2>流體萃取.采用三因子二次通用旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)

4、實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:乙醇添加量、萃取壓力和萃取溫度對(duì)CGA的提取率有極顯著的影響,乙醇添加量15％、萃取壓力63.94MPa、萃取溫度72℃和萃取3h后,CGA提取率的理論極值為44.14％.三種提取方法中,甲醇的提取率最高,其次是水溶液提取法,而超臨界CO<,2>流體萃取法最低.探討了大孔吸附樹脂法對(duì)CGA和CA分離的影響.實(shí)驗(yàn)選擇了九種大孔樹脂為實(shí)驗(yàn)材料,研究和分析了各自對(duì)CGA和CA的吸附和解吸性能.結(jié)果表明:AD-8大孔樹脂對(duì)CGA

5、和CA適于CGA和CA的分離和精制;AB-8樹脂的吸附條件:溶液pH值為4.5,8h內(nèi)吸附量可達(dá)平衡吸附量的95％以上,飽和吸附量可達(dá)40.40mg/g;采用4BV、pH值為4.5水溶液2BV/h流速淋洗后,再以5BV的70％的乙醇溶液、1BV/h的流速解吸,可較好地分離CGA和CA,解吸率分別為75.02％和79.78％.研究了高速逆流色譜法對(duì)CGA和CA分離純化的效果.結(jié)果表明:選擇合適溶劑系統(tǒng)已烷/乙酸乙酯/甲醇/0.5mol鹽酸

6、(3:7:5:5;v/v/v/v),在流動(dòng)相流速1.5mL/min、鼓體轉(zhuǎn)速1000rpm、進(jìn)樣濃度30mg/mL條件下,可以有效分離純化CGA和CA,分離所得部分經(jīng)RP-HPLC、<'1>HNMR和紅外光譜法判定結(jié)構(gòu),基本證實(shí)為純品.以體外培養(yǎng)ECV-304內(nèi)皮細(xì)胞為試材,選用氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞為模型,從ECV-304的形態(tài)、生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性、丙二醛和一氧化氮含量、乳酸脫氫酶釋放率、總抗氧化能力的測(cè)定以及