鹽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞腎上腺髓質(zhì)素分泌和表達(dá)的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:(1)研究高鹽對(duì) HUVECs增殖活性的影響。(2)研究高鹽對(duì)HUVECs ADM、ADMR mRNA表達(dá)的影響,探討其可能的信號(hào)通路。(3)研究高鹽對(duì)HVECs凋亡的影響及可能機(jī)制。
　　方法:1.用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs,選3-9代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.用不同濃度 NaCl(對(duì)照組、137mmol/L、142mmol/L、147mmol/L、152mmol/L、157mmol/L

2、)干預(yù)HVECs24h后,用CCK-8試劑盒檢測(cè)鹽對(duì)HUVECs增殖活性的影響。3.將實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)1:實(shí)驗(yàn)共分六組,分別為對(duì)照組:正常培養(yǎng)HUVECs未加入任何藥物;137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組分別為:培養(yǎng)24小時(shí)后加入不同濃度NaCl,使終濃度分別為137mmol/L、142mmol/L、147mmol/L、152mmol/L、157mmol/L

3、,繼續(xù)作用24小時(shí)后,用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中ADM及ADMR mRNA的表達(dá);用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中ADM及ADMR濃度;用AnnexinV-FTTC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)2:通過(guò)實(shí)驗(yàn)1選出最佳鹽濃度為152mmol/L,繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分六組如下:152 mmol/l組:培養(yǎng)48小時(shí)后加入NaCl,終濃度為152mmol/L,繼續(xù)作用24小時(shí)。PD98059(ERK抑制劑)組、SP6001

4、25(JNK抑制劑)組、SB203508(P38抑制劑)組、Staurosporine( PKC抑制劑)組、LY-294002(PI3K抑制劑)組:培養(yǎng)24小時(shí)后,先分別用PD98059、SP600125、SB203508、Staurosporine、LY-294002作用細(xì)胞24h再加入 NaCl(終濃度為152mmol/L),繼續(xù)作用24小時(shí)。(其中除Staurosporine為10nmol/L外,其余均為10umol/L),并以與

5、實(shí)驗(yàn)1相同方法檢測(cè)ADM的濃度, ADM及ADMR mRNA的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:1、對(duì)照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組細(xì)胞增殖活力分別為(0.998±0.197)、(0.952±0.091)、(0.946±0.076)、(0.811±0.145)、(0.802±0.116)、(0.659±0.15)。137mmol/L組、142mmo

6、l/L組、147mmol/L組、152mmol/L組與對(duì)照組比較(P>0.05),157 mmol/L組與對(duì)照組比較(P<0.05)。2、RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中ADM及ADMR mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示:對(duì)照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組ADM mRNA的IODADM/IODGAPDH分別為0.03±0.01、0.10±0.01、0.20±0.01、0.

7、21±0.02、0.43±0.02、0.40±0.04,各組與對(duì)照組相比(P<0.05);對(duì)照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組 ADMR mRNA的IODADMR/IODGAPDH分別為0.07±0.02、0.12±0.02、0.13±0.02、0.16±0.02、0.28±0.03、0.17±0.02,各組與對(duì)照組相比P均小于0.05;152mmol/L組

8、、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurospo rine組、LY-294002組ADM mRNA的IODADM/IODGAPDH分別為0.10±0.01、0.15±0.02、0.29±0.04、0.31±0.02、0.17±0.02、0.15±0.01, SP600125組、SB203508組與152mmol/L組相比(P<0.05),PD98059組、Staurosporine組、LY-294002組與

9、152mmol/L組相比(P>0.05);152mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組ADMR mRNA的IODADMR/IODGAPDH分別為0.08±0.01、0.20±0.01、0.22±0.03、0.23±0.02、0.09±0.01、0.09±0.02,PD98059組、SP600125組、SB203508組與152mmol/L組相比(P<0

10、.05),Staurosporine組、LY-294002組與152mmol/L組相比(P>0.05)。3、ELISA法檢測(cè)ADM結(jié)果顯示:對(duì)照組、137mmol/L組、142mmol/L組、147mmol/L組、152mmol/L組、157mmol/L組ADM的濃度(pg/ml)分別為20.13±0.15、34.91±0.59、41.15±0.79、41.30±1.13、43.16±1.04、34.68±0.27,各組與對(duì)照組比較(P

11、<0.05),152mmol/L組與157mmol/L組相比(P<0.05)。152mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組ADM的濃度(pg/ml)分別為43.16±1.04、51.50±8.28、72.23±2.23、75.33±2.93、44.95±3.33、36.33±3.78,SP600125組、SB203508組與152mmol/L組比較(P

12、<0.05),PD98059組、Staurosporine組、LY-294002組與152mmol/L組比較(P>0.05)。4、AnnexinV-FTTC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:對(duì)照組、152 mmol/L組、PD98059組、SP600125組、SB203508組、Staurosporine組、LY-294002組凋亡率分別為2.3±0.73％、30.07±2.13％、14.35±1.56％、13.47±0.99

13、％、10.19±1.12％、35.7±2.01％、59.8±3.19％,各組與對(duì)照組相比(P<0.05),PD98059組、SP600125組、SB203508組、LY-294002組與152 mmol/L組相比(P<0.05),Staurosporine組與152 mmol/L組相比(P>0.05)。
　　結(jié)論:1、高鹽抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。2、高鹽通過(guò)MAPK通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞ADM、ADMR mRNA的表達(dá)。3、高鹽能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞