腎上腺髓質(zhì)素在黑素瘤中的表達(dá)和作用.pdf

1、惡性黑色素瘤是所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤之一,近年來受到廣泛重視,其臨床研究也進(jìn)展迅速。黑素瘤的惡性程度高、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,研究顯示腫瘤厚度>3mm的患者5年存活率不足60％,發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后其平均生存期僅為6—9個(gè)月,5年生存率<5%。因此全面深入的研究黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找能夠有效預(yù)測(cè)其生物學(xué)行為的指標(biāo),對(duì)其早期診斷、指導(dǎo)治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)是

2、內(nèi)源性血管活性肽,是日本學(xué)者于1993年在嗜鉻細(xì)胞瘤組織中發(fā)現(xiàn)的。MillerMJ等觀察了肺、腸、乳腺、卵巢、前列腺、腦、軟骨、血液等組織來源的人腫瘤細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)超過90%的腫瘤高表達(dá)ADM,并指出ADM在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。ADM是否在黑素瘤也高表達(dá)及是否發(fā)揮了一定的生物學(xué)作用,需要研究證實(shí)。
　　第一部分:ADM在惡性黑素瘤中的表達(dá)
　　目的:
　　檢測(cè)ADM在人黑素瘤、色素痣組織及黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)37

3、5中的表達(dá),以探討ADM在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　用免疫組化法檢測(cè)ADM在人黑素瘤、色素痣組織切片及A375中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　惡性黑素瘤組織標(biāo)本中80%檢測(cè)到ADM的表達(dá),色素痣組織標(biāo)本中僅有43.3%檢測(cè)到ADM的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。人的成纖維細(xì)胞中ADM為弱陽性、A375中ADM呈強(qiáng)陽性。
　　結(jié)論:
　　腎上腺髓質(zhì)素在人惡性黑素瘤組織及細(xì)胞系

4、A375中高表達(dá),在人的色素痣和成纖維細(xì)胞中低表達(dá),提示ADM與惡性黑素瘤發(fā)生、發(fā)展可能密切相關(guān)。
　　第二部分:AMD在黑素瘤中的作用
　　目的:
　　探討siRNA沉默腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)基因后對(duì)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375增殖、凋亡、周期及侵襲力的影響。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組:采用人黑素瘤細(xì)胞株A375,利用人工合成的ADM靶向小分子干擾RNA(smallinterfe

5、renceRAN,siRNA)轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,以抑制ADM的表達(dá),利用人工合成的非特異序列轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞,作為陰性對(duì)照,同時(shí)以正常未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞做為空白對(duì)照。
　　2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)處理后各組細(xì)胞ADM的表達(dá)情況,進(jìn)而選擇最有效siRNA。
　　3.用最有效的siRNA轉(zhuǎn)染A375,分別于24、48h后用MTT法測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后,用流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡情況。
　　5.轉(zhuǎn)染48h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期情況。
　　6.轉(zhuǎn)染24h后,Transwell測(cè)定沉默ADM對(duì)A375體外侵襲力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.基因干擾后qRT-PCR篩選有效siRNA結(jié)果:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干擾率分別為:15%,76%,50%。siRNA-2干擾效果最好。
　　2.轉(zhuǎn)染后免細(xì)胞化學(xué)法篩選有效siRNA結(jié)果:空白對(duì)照組

7、和轉(zhuǎn)染非特異序列組ADM的染色呈強(qiáng)陽性,陽性細(xì)胞數(shù)均在90%以上,兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3陽性細(xì)胞數(shù)分別為80%,35%,90%。siRAN-2組染色強(qiáng)度明顯弱于其他組。ADMsiRNA-2干擾效果最好。
　　3.基因干擾后細(xì)胞的增殖率:用ADMsiRAN-2轉(zhuǎn)染A37524、48h后各組OD值示:空白對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而轉(zhuǎn)染siRN

8、A的細(xì)胞與前兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24、48h的抑制率分別為32.2%、31.5%。
　　4.沉默ADM后A375細(xì)胞的凋亡情況:轉(zhuǎn)染48h后用AnnexinV-EGFP/PI染色在流式細(xì)胞儀檢測(cè),結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染siADM的細(xì)胞早期凋亡率(20.20±6.045)%;空白對(duì)照細(xì)胞組的早期凋亡率(1.67±0.340)%;陰性對(duì)照細(xì)胞的早期凋亡率(4.59±1.294)%,轉(zhuǎn)染siADM的細(xì)胞與空白對(duì)照和陰性對(duì)照

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而空白對(duì)照細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.沉默ADM后細(xì)胞DNA周期分布:轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比率為(11.360±1.224)%;明顯高于空白對(duì)照(1.02±0.990)%和陰性對(duì)照組(4.150±1.032)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),空白對(duì)照與陰性對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞G1/G0、S期分別是(69.4

10、43±2.022)%、(19.197±0.890)%與空白對(duì)照(68.567±3.653)%、(30.417±4.588)%和陰性對(duì)照(70.530±3.008)%、(23.313±4.465)%,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　6.沉默ADM基因后A375體外侵襲力檢測(cè)結(jié)果:轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞的穿膜數(shù)為43.750±3.772,明顯少于空白對(duì)照的70.500±2.723和陰性對(duì)照組的67.500±3.795,差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照與陰性對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTT法顯示轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞的穿膜細(xì)胞的OD值為0.185±0.055,低于空白對(duì)照的0.363±0.006和陰性對(duì)照的0.361±0.086,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),空白對(duì)照與陰性對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1沉默ADM基因可抑制A375細(xì)胞的生長(zhǎng)；
　　2沉默ADM基因可促進(jìn)A375細(xì)胞的凋亡；