腎上腺髓質(zhì)素和內(nèi)皮素在糖尿病大鼠腎組織的表達(dá).pdf

1、目的：糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是一種慢性腎臟病變。隨著人民生活水平的提高和人口的老齡化，糖尿病(Diabetesmellitus，DM)發(fā)病率逐年上升，糖尿病腎病是糖尿病的最常見(jiàn)的并發(fā)癥，糖尿病患者一旦發(fā)生蛋白尿則病情不可逆轉(zhuǎn)，往往發(fā)展至終末期腎功能衰竭。因此，探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，尋求有效的防治措施，預(yù)防其發(fā)生、延緩其進(jìn)展，具有重大意義。 腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM

2、)是日本學(xué)者Kitamura等[1]于1993年從人的腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤中分離純化出的一種由52個(gè)氨基酸組成的多肽。其生物學(xué)效應(yīng)廣泛，有明顯的舒張血管、降低血壓、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等功能，在腎臟功能調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是一種由21個(gè)氨基酸組成的多肽，具有強(qiáng)烈收縮血管和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖作用，其中最重要的是ET-1。ET-1對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用。已有資料表明，腎小球高濾過(guò)和高灌注是DN的

3、始動(dòng)因素，能誘發(fā)糖尿病性腎小球硬化，血管活性物質(zhì)在其中發(fā)揮著重要作用，ADM和ET-1都是重要的血管活性物質(zhì)。但有關(guān)ADM和ET-1在DN發(fā)病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用糖尿病大鼠模型，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)從蛋白和mRNA水平，檢測(cè)DN時(shí)ADM、ET-1及受體表達(dá)情況，以及在DN發(fā)病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化并探求其機(jī)制。 方法：用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘發(fā)單側(cè)腎切除大鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型。健康雄性Wist

4、ar大鼠右側(cè)腎切除兩周后，隨機(jī)分為右腎切除對(duì)照組(A組)和糖尿病組(B組)，每組24只。B組大鼠腹腔單次注射STZ(STZ65mg/kgWT，用pH4.5，0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液配制)，A組只注射相同體積的枸櫞酸鈉緩沖液。48～72h后，血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++的大鼠確定為糖尿病模型。分別在注射STZ后第1周、2周、4周和6周各取動(dòng)物6只，代謝籠留取24h尿，股動(dòng)脈取血分離血清，測(cè)定腎功能。切取腎臟進(jìn)行以

5、下觀察：①石蠟包埋行HE和PAS染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎小球系膜基質(zhì)、腎小球及腎小管基底膜增厚情況等病理改變。②免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎組織中腎上腺髓質(zhì)素、腎上腺髓質(zhì)素受體(Adrenomedullinreceptor,ADMR)、內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素受體A(EndothelinreceptortypeA，EDNR-A)蛋白水平的表達(dá)。③Western印跡檢測(cè)腎皮質(zhì)組織中ADMR和EDNR-A蛋白水平的表達(dá)。④原位雜交方法檢測(cè)腎組織中ADM在

6、mRNA水平上的表達(dá)。⑤逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetransecriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)方法檢測(cè)腎皮質(zhì)組織中ET-1mRNA的表達(dá)。⑥統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用-x±s表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。 結(jié)果1.體重、腎重和腎重/體重比的變化：B組大鼠在2周時(shí)體重己明顯減輕，腎重和腎重/體重比較A組明顯增加(P＜0.01)。

7、 2.腎功能測(cè)定：B組與A組相比血糖、BUN和尿蛋白增高(P＜0.01)，Ccr則B組與A組相比顯著降低(P＜0.01)。 3.光鏡下觀察：B組與A組相比，腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多。 4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：①ADM的表達(dá)：A組腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中均呈陽(yáng)性表達(dá)；B組各期表達(dá)均顯著高于A組，且在1周、2周、4周表達(dá)有逐漸增加趨勢(shì)，在4周表達(dá)最顯著，6周時(shí)表達(dá)較4周減弱。②ADMR的表達(dá)：A組ADMR陽(yáng)性

8、顆粒見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)；B組表達(dá)明顯增強(qiáng)，且從1周、2周、4周至6周，表達(dá)依次增強(qiáng)。③ET-1的表達(dá)：A組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均有陽(yáng)性表達(dá)；B組1周時(shí)表達(dá)弱于A組，2周、4周、6周表達(dá)顯著強(qiáng)于A組且有逐漸增加趨勢(shì)。④EDNR-A的表達(dá)：A組在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均有陽(yáng)性表達(dá)；B組表達(dá)明顯增強(qiáng)，且從1周、2周、4周至6周表達(dá)依次增強(qiáng)。

9、 5.Western印跡結(jié)果：①ADMR的表達(dá)：A組ADMR(分子量42kDa)的表達(dá)較弱，B組表達(dá)較A組增高，呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，6周表達(dá)最顯著；ADMR二聚體(分子量86kDa)也有相同的變化趨勢(shì)(P＜0.01)。②EDNR-A(分子量45kDa)的表達(dá)：B組較A組表達(dá)明顯增強(qiáng)，且從1周、2周、4周至6周表達(dá)依次增強(qiáng)(P＜0.01)。 6.原位雜交檢測(cè)ADMmRNA的表達(dá)：ADMmRNA陽(yáng)性顆粒在腎小管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)

10、皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)。A組ADMmRNA表達(dá)較弱，B組各期表達(dá)較A組均明顯增高，且在1周、2周、4周表達(dá)有逐漸增加趨勢(shì)，4周表達(dá)最顯著，6周時(shí)表達(dá)弱于4周。 7.RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)ET-1mRNA的表達(dá)：B組1周時(shí)表達(dá)弱于A組，2周、4周、6周表達(dá)顯著強(qiáng)于A組且有逐漸增加趨勢(shì)(P＜0.01)。 結(jié)論1.在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腎組織ADM及其受體出現(xiàn)一過(guò)性過(guò)度表達(dá)，且在mRNA和蛋白水平表達(dá)一致，其意義有待進(jìn)一步研究