抑制自噬對內(nèi)皮祖細胞促進靜脈血栓機化再通的影響的實驗研究.pdf

1、目的：研究特定濃度的3-甲基腺嘌呤（3-methlyadenine，3-MA）作用后的血管內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）對于促進大鼠靜脈血栓再通的影響，為臨床治療肢體深靜脈血栓形成（Deep vein thrombosis）提供一種全新有效的思路和實驗依據(jù)。
　　方法：1. Ficoll密度梯度離心法獲取SD（Sprague-Dawley）大鼠(80-100g)的骨髓單個核細胞（

2、bone marrow-derived mononuclear cells，BMMNCs），內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基（EGM-2MV）體外誘導(dǎo)分化為 EPCs并進行鑒定。2.將60只SD（Sprague-Dawley）大鼠(250-300g)分成四組，每組15只，對大鼠下腔靜脈采用近端絲線結(jié)扎法加遠端三氯化鐵腐蝕法，成功制作下腔靜脈血栓模型；動物下腔靜脈血栓模型做好后，每組動物模型自一側(cè)股靜脈注射藥物或細胞：A組：15只，空白對照組，注射生理鹽

3、水；B組：15只，注射移植EPCs1ml(含細胞1×106）；C組：15只，注射3-MA1ml（濃度為5mmol/l）；D組：15只，注射經(jīng)濃度為5mmol/l3-MA處理的EPCs；在不同時間點處死動物并取出動物血栓標(biāo)本，送蘇木精—伊紅染色(HE染色)，高倍顯微鏡下計數(shù)超薄標(biāo)本切片血栓再通的毛細血管密度，觀察不同藥物及種子細胞對靜脈血栓機化再通的作用；對不同時間點處死的動物血栓標(biāo)本行 Western blot法檢測VEGF、bFGF、

4、Ang-1、MCP-1四種促進血栓機化與再通的細胞因子的蛋白表達。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.新分離的骨髓單個核細胞(BMMNCs)呈圓形，大小不一，第3天左右大部分細胞開始貼壁，形態(tài)有梭形、三角形、紡錘形或不規(guī)則形，第5-8天左右出現(xiàn)細胞集落和細胞線狀排列，第8-12天接近融合，呈典型鵝卵石樣外觀。貼壁細胞的CD34、VEGFR、vWF、CD133均表達陽性。說明體外誘導(dǎo)

5、培養(yǎng)的細胞是血管內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）。2.在400倍光學(xué)顯微鏡下各時間點血栓標(biāo)本切片內(nèi)可見血栓干燥收縮或部分溶解而出現(xiàn)裂隙，新生的血管內(nèi)皮細胞長入并被覆于裂隙表面形成新的管腔樣結(jié)構(gòu)，經(jīng)大鼠股靜脈注射使用0.5ml濃度為5mmol/l的3-MA處理后的EPCs組動物模型血栓標(biāo)本可見大量管腔樣結(jié)構(gòu)的縱切面及橫切面，管腔內(nèi)可見數(shù)量不等的紅細胞；血栓標(biāo)本石蠟切片HE染色顯示在建模10

6、天后的第7、14、28天形成的管腔樣結(jié)構(gòu)多于建模10天后的第0天；本組各時間點血栓標(biāo)本石蠟切片HE染色均顯示毛細血管形成密度比B組（注射移植EPCs組）、A組（注射生理鹽水組）及C組（注射3-MA組）為多，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；注射濃度為5mmol/l3-MA處理的EPCs的血栓模型標(biāo)本中，VEGF、bFGF、Ang-1、MCP-1四種促進血栓機化與再通的細胞因子蛋白表達量明顯高于其他組，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。