低頻振動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流和自噬流的影響及分子機(jī)制.pdf

1、前庭功能障礙嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量，尤其是眩暈。前庭功能紊亂或障礙帶來的周圍型眩暈有著較高的發(fā)病率，如常見的梅尼埃病，除了前庭癥狀外，該病還伴有耳悶、耳鳴以及聽力下降等耳蝸癥狀。藥物治療、手法操作、手術(shù)治療以及各種前庭康復(fù)廣為開展。低頻振動(dòng)作為新穎的治療手段在門診治療中，改善了患者的總體感覺，控制了眩暈，減輕耳鳴和耳悶癥狀，并增加了患者的頭部舒適感。本研究觀察了低頻振動(dòng)對(duì)單側(cè)前庭功能低下患者眩暈恢復(fù)的促進(jìn)作用，經(jīng)乳突投放低頻振動(dòng)，

2、明顯促進(jìn)了眩暈的康復(fù)過程。為了進(jìn)一部探尋低頻振動(dòng)在治療眩暈癥狀上的作用機(jī)制，從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)上探索低頻振動(dòng)是如何達(dá)到控制并改變內(nèi)耳前庭細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)課題利用公認(rèn)研究脈管系統(tǒng)的模型細(xì)胞，即人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，建立其轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3腺病毒和線粒體毒素干擾自噬的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。觀察低頻振動(dòng)對(duì)HUVEC細(xì)胞鈣內(nèi)流和自噬流的影響，并與氟桂利嗪陽性對(duì)照組比較。采用磷酸化廣譜篩選抗體芯片，分析低頻振動(dòng)對(duì)線粒體損傷的HUVE

3、C細(xì)胞的信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的影響，進(jìn)而探索低頻振動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的分子機(jī)制。
　　第一部分低頻振動(dòng)剪切應(yīng)激治療單側(cè)前庭功能低下的療效分析
　　目的：探討低頻振動(dòng)在單側(cè)前庭功能低下患者眩暈康復(fù)中的作用。
　　方法：共收集我院門診的診斷為單側(cè)前庭功能低下患者25人，均為前庭神經(jīng)元炎后遺癥，分為低頻振動(dòng)治療組和常規(guī)前庭康復(fù)治療組。低頻振動(dòng)治療組采用經(jīng)患側(cè)乳突進(jìn)行100Hz低頻振動(dòng)，每次30分鐘，每周2次，連續(xù)

4、治療2周。前庭康復(fù)治療組患者在康復(fù)科康復(fù)治療師指導(dǎo)下采用TECNOBODY平衡測(cè)試及訓(xùn)練系統(tǒng)進(jìn)行感覺整合訓(xùn)練、前庭功能訓(xùn)練、重心控制訓(xùn)練。兩組患者分別于治療前、治療后進(jìn)行DHI評(píng)分及VVAS評(píng)分。所有計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式記錄，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。計(jì)量資料采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：按照DHI總分改善18分以上為有效，低頻振動(dòng)治療組總有效率為76.9％(10/13)，前庭康復(fù)

5、組為83.3％(10/12)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：經(jīng)乳突低頻振動(dòng)與傳統(tǒng)的前庭康復(fù)鍛煉對(duì)眩暈癥狀的改善效率相當(dāng)，對(duì)患者無其他不良影響。相對(duì)于前庭康復(fù)鍛煉需要專業(yè)的康復(fù)師和專業(yè)的場(chǎng)地而言，低頻振動(dòng)治療前庭功能障礙操作簡(jiǎn)便，對(duì)場(chǎng)地?zé)o特殊要求，技術(shù)員培訓(xùn)難度低。本研究結(jié)果顯示，低頻振動(dòng)治療前庭功能低下的短期效果明顯，長(zhǎng)期效果還需要增加樣本量及進(jìn)一步延長(zhǎng)隨訪時(shí)間。
　　第二部分低頻振動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)

6、流的影響
　　目的：了解低頻振動(dòng)在調(diào)節(jié)人臍血內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流方面的作用。
　　方法：利用人臍血內(nèi)皮細(xì)胞(HUEVC)作為模型細(xì)胞，用FLUO-3鈣離子示蹤劑顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子的實(shí)時(shí)變化，用3-NP處理建立細(xì)胞損傷的模型，用低頻振動(dòng)對(duì)其進(jìn)行治療干預(yù)，用氟桂利嗪作為陽性對(duì)照。通過熒光顯微鏡結(jié)合圖像分析和半定量測(cè)試，實(shí)時(shí)觀察3-NP誘導(dǎo)鈣內(nèi)流的變化以及低頻振動(dòng)干預(yù)治療后，細(xì)胞鈣內(nèi)流發(fā)生的改變。
　　結(jié)果：與正常細(xì)胞相比，3NP處

7、理后的HUEVC細(xì)胞，綠色熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。3NP處理后的HUEVC細(xì)胞，分別施加低頻振動(dòng)，或者加入氟桂利嗪，在3NP+低頻振動(dòng)組和3NP+氟桂利嗪組，分別在1分鐘，5分鐘，15分鐘，20分鐘，30分鐘，與3-NP處理后的HUVEC細(xì)胞，即造模細(xì)胞相比，在不同時(shí)間點(diǎn)的比較上，綠色熒光強(qiáng)度明顯降低，鈣超載水平逐步降低。通過半定量熒光值的統(tǒng)計(jì)分析，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：低頻振動(dòng)可以明顯降低了因受線粒體損傷而

8、增強(qiáng)的鈣內(nèi)流。
　　第三部分低頻振動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬流的影響
　　目的：了解低頻振動(dòng)在調(diào)節(jié)內(nèi)耳血管功能方面的可能自噬因素。
　　方法：利用人臍血內(nèi)皮細(xì)胞(HUEVC)作為模型細(xì)胞，用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染使其表達(dá)熒光標(biāo)記自噬標(biāo)志性的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，用3-NP處理建立細(xì)胞損傷的模型，用低頻振動(dòng)對(duì)其進(jìn)行治療干預(yù)，用氟桂利嗪作為陽性對(duì)照。通學(xué)過激光共聚焦顯微鏡，從形態(tài)學(xué)上，實(shí)時(shí)觀察3-NP誘導(dǎo)自噬

9、流的變化。用全自動(dòng)流式細(xì)胞儀，定量觀測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3腺病毒后的HUVEC細(xì)胞自噬流的變化。
　　結(jié)果：與正常細(xì)胞相比，3NP處理減少了自噬小體（綠色）的數(shù)量，更多地與溶酶體融合（黃和紅色）。在經(jīng)3NP處理后，分組分別加入氟桂利嗪，或者低頻振動(dòng)，在3NP低頻振動(dòng)和氟桂利嗪均明顯提高了HUVEC細(xì)胞的自噬率。定量熒光值的統(tǒng)計(jì)分析，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：低頻振動(dòng)可以明顯提高了因受因?yàn)榫€粒體損傷而降低的自

10、噬水平。低頻振動(dòng)有可能通過影響細(xì)胞的自噬，而抑制過渡的炎癥反應(yīng)，從而緩解內(nèi)耳損傷的病理過程。
　　第四部分低頻振動(dòng)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的分子機(jī)制
　　目的：探索低頻振動(dòng)對(duì)線粒體損傷后HUVEC細(xì)胞的信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的影響，進(jìn)而研究低頻振動(dòng)干預(yù)線粒體損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞病理過程的分子機(jī)制。
　　方法：采用信號(hào)通路磷酸化廣譜篩選抗體芯片(PEX100)，利用三維高分子膜專利技術(shù)，在片基上高密度結(jié)合1318

11、種高特異抗體。對(duì)HUVEC細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白進(jìn)行檢測(cè)。共分為四組，空白對(duì)照組，3-NP造模組，3-NP+氟桂利嗪組以及3-NP+低頻振動(dòng)組。以氟桂利嗪，鈣離子阻滯劑作為陽性對(duì)照。對(duì)4組細(xì)胞分別進(jìn)行檢測(cè)432個(gè)信號(hào)蛋白的679個(gè)磷酸化位點(diǎn)。對(duì)檢測(cè)出的通道進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，公式計(jì)算，組間比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：與3-NP造模組未受干預(yù)的細(xì)胞相比，低頻振動(dòng)組增加其磷酸化水平6倍以上的主要信號(hào)通路蛋白有:NMDAR2B(Phosp

12、ho-Tyr1472)，MEK1(Phospho-Ser298)，Lamin A/C(Phospho-Ser392)，HDAC1(Phospho-Ser421)，PECAM-1(Phospho-Tyr713),P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363)，P90RSK(Phospho-Thr573)，LAT(Phospho-Tyr171),PP2A-alpha(Phospho-Tyr307)，Merlin(Phospho-

13、Ser10)，MKK4/SEK1(Phospho-Ser80),BLNK(Phospho-Tyr96)，14-3-3zeta/delta(Phospho-Thr232)。與3-NP造模組未受干預(yù)的細(xì)胞相比，低頻振動(dòng)組增加其磷酸化水平6倍以上的主要信號(hào)通路蛋白有:NMDAR2B(Phospho-Tyr1472)，MEK1(Phospho-Ser298)，LaminA/C(Phospho-Ser392)，HDAC1(Phospho-Ser4

14、21)，PECAM-1(Phospho-Tyr713)，P90RSK(Phospho-Thr359/Ser363),P90RSK(Phospho-Thr573)，LAT(Phospho-Tyr171)，PP2A-alpha(Phospho-Tyr307)，Merlin(Phospho-Ser10)，MKK4/SEK1(Phospho-Ser80)，BLNK(Phospho-Tyr96),14-3-3zeta/del(Phospho-Th