EphrinB2蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、自噬及信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的:血管內(nèi)皮功能嚴(yán)重影響著冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程。血管內(nèi)皮功能紊亂可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、斑塊進(jìn)展以及冠心病并發(fā)癥發(fā)生。Ephrin-B2是血管發(fā)生及血管內(nèi)皮功能調(diào)控中的一個(gè)重要的調(diào)控因子。Ephrin-B2可通過(guò)調(diào)控受體酪氨酸激酶(RTKs)家族成員的功能來(lái)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞的遷移，增殖，粘附，細(xì)胞間信號(hào)傳遞等生物過(guò)程。然而其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能及信號(hào)通路方面的研究仍未完善，且缺乏磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)

2、水平上的研究。本課題運(yùn)用液-質(zhì)聯(lián)用色譜法從磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)水平上探究人重組ephrin-B2/Fc蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響，分析并揭示差異表達(dá)的磷酸化蛋白所參與的細(xì)胞和分子功能、毒性作用、信號(hào)通路、疾病和生物學(xué)功能、相互作用網(wǎng)絡(luò)等。并在細(xì)胞水平上探究人重組ephrin-B2/Fc蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、自噬等功能及信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)結(jié)果。為探索ephri

3、n-B2在血管內(nèi)皮功能紊亂中的保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的治療提供新的思路。
　　方法:從新生兒臍帶中原代分離、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記1ug/ml ephrin-B2/Fc蛋白處理組及對(duì)照組HUVECs，液-質(zhì)聯(lián)用色譜法檢測(cè)ephrin-B2/Fc蛋白對(duì)HUVECs內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平的影響并用IPA平臺(tái)對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)行生物信息學(xué)分析。用CCK8法檢測(cè)不同濃度(0，0.1，0.3，1ug/

4、ml)的ephrin-B2/Fc蛋白處理HUVECs1，3，5，7天對(duì)細(xì)胞增殖的影響;依據(jù)不同濃度（0.1，0.3，0.5，1mmol/l）的過(guò)氧化氫對(duì)HUVECs凋亡的影響，選取適宜的促凋亡濃度;檢測(cè)不同濃度的ephrin-B2/Fc蛋白預(yù)處理2小時(shí)對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的保護(hù)作用。用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度(0，0.1，0.3，1，3ug/ml)的ephrin-B2/Fc蛋白對(duì)HUVECs遷移的影響。用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢

5、測(cè)ephrin-B2/Fc蛋白處理不同時(shí)間(5min，15min，30min，1h，2h)后HUVECs內(nèi)增殖凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、caspase-3，遷移相關(guān)蛋白Twist、MMP9，自噬相關(guān)蛋白LC3B、P62，信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-Akt、Akt、eNOS、p-P38、P38的表達(dá)。
　　結(jié)果:磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，ephrin-B2/Fc蛋白處理后，HUVECs內(nèi)差異表達(dá)的磷

6、酸化蛋白與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，細(xì)胞死亡和存活，細(xì)胞遷移，血管生成，細(xì)胞凋亡等分子及生物學(xué)功能密切相關(guān)，且與整合素，Rho GTPase，ERK5，IGF-1，Rac，ERK/MAPK，VEGF，PI3K/AKT等信號(hào)通路密切相關(guān)。Ephrin-B2/Fc可促進(jìn)HUVECs增殖，且其促增殖作用呈時(shí)間依賴性及濃度依賴性。過(guò)氧化氫可促進(jìn)HUVECs凋亡，且其促凋亡作用呈濃度依賴性;1ug/ml的ephrin-B2/Fc可抑制過(guò)氧化氫引起的HUVE

7、Cs凋亡。Ephrin-B2/Fc可促進(jìn)HUVECs遷移，且其促遷移作用呈濃度依賴性。Ephrin-B2/Fc處理一定時(shí)間可增加HUVECs內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2，促遷移蛋白Twist、MMP9，信號(hào)通路蛋白pAkt、eNOS、pP38的表達(dá)，減少促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達(dá)，對(duì)促凋亡蛋白Bax、自噬底物P62的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:Ephrin-B2/Fc可上調(diào)入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)增殖、遷移相關(guān)蛋白的表