抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞自噬對在血栓機(jī)化再通的實驗研究(二).pdf

1、目的：應(yīng)用適量自噬抑制劑3-MA（3-甲基腺嘌呤）作用于內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）后，移植到大鼠深靜脈血栓模型體內(nèi)，探討干預(yù)后的 EPCs在血栓機(jī)化再通中的作用，進(jìn)而為下肢深靜脈血栓治療提供一種新的思路和實驗依據(jù)。
　　方法：1.Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠來源的骨髓單個核細(xì)胞（bone marrow-derived mononuclear cells，BMMNCs）

2、，經(jīng)內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM-2MV）體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴(kuò)增EPCs，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，MTT法檢測EPCs增殖情況。采用內(nèi)皮細(xì)胞系列標(biāo)志：CD133、CD34免疫熒光技術(shù)及VEGFR-2、vWF免疫組化對其進(jìn)行鑒定。利用三維培養(yǎng)實驗證實EPC具有形成血管能力。采用MTT比色法測定各濃度3-MA及對照組EPCs增殖的作用。
　　2.血栓模型建立：采用縮窄腎下段下腔靜脈結(jié)合三氯化鐵浸潤破壞血管內(nèi)膜方法建立大鼠深靜脈血栓模

3、型，并飼養(yǎng)至10天，備移植用。動物隨機(jī)分四組，經(jīng)大鼠股靜脈穿刺注射移植液體。A組(n=15)：空白對照組，注射生理鹽水；B組（n=15）EPCs移植組，移植lml含有106個EPCs的細(xì)胞懸液；C組(n=15)：注射3-MA稀釋液（5mmol/l）；D組(n=15)：移植1ml含有經(jīng)5mol/l3-MA處理后的EPCs的細(xì)胞懸液。3．移植后分四個時間段（0天、7天、14天、28天）取出血栓段下腔靜脈及血栓，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測各組血栓

4、中新生血管及機(jī)化再通的情況。實時熒光定量PCR檢測各組標(biāo)本中VEGF，bFGF，MCP-1，Ang-1 mRNA表達(dá)情況。4．采用SPSSl7.0軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：1.剛分離的骨髓單個核細(xì)胞(BMMNCs)大小不一，呈圓形，第3天左右細(xì)胞逐漸貼壁，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、卵圓形、紡錘形、三角形或不規(guī)則形，一周左右可見細(xì)胞集落、細(xì)胞呈線狀排列，第10天左右細(xì)胞呈典型鵝卵石樣外觀。細(xì)胞生長曲線呈“S”形，EPCs在培養(yǎng)的5~11

5、天時增殖較快，13天后進(jìn)入平臺期，生長曲線呈典型“S”形外觀。貼壁細(xì)胞的CD34、VEGF、vWF、CD133均表達(dá)陽性。成血管實驗顯示：EPCs細(xì)胞間首尾相連，形成管腔樣結(jié)構(gòu)。MTT顯示，與對照組相比較，3-MA在濃度5mmol/l對于EPCs的增殖有明顯的促進(jìn)作用。
　　2.體外成功誘導(dǎo)培養(yǎng)了大鼠骨髓源性EPCs；vWF免疫組化顯示D組的血栓再通毛細(xì)血管密度明顯高于其他三組，D、B之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A、C組之間差異無統(tǒng)計學(xué)