內(nèi)皮祖細(xì)胞對腎臟急性缺血再灌注損傷的影響.pdf

1、腎臟缺血再灌注損傷（Ischemia reperfusion injury，IRI）是臨床上一種常見的病理生理過程，在急慢性腎衰、移植后排斥反應(yīng)等的發(fā)病中具有重要作用，目前尚無有效的干預(yù)方法。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種具有定向歸巢、自我更新、增殖分化特性的多能干細(xì)胞，在體內(nèi)可募集、歸巢到血管或組織損傷部位，通過分泌血管生成因子以及分化機(jī)制，參與損傷臟器血管新生以

2、及組織修復(fù)等，從而減輕器官的IRI，達(dá)保護(hù)臟器的目的。
　　 本研究通過建立大鼠急性IRI模型，EPCs移植，觀察EPCs在IRI腎臟的歸巢情況及其對腎臟的保護(hù)作用，并從旁分泌機(jī)制探索EPCs移植對IRI腎臟血管新生因子的影響。
　　 第一部分大鼠骨髓源性EPCs的提取、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：獲取特異、穩(wěn)定、足量的大鼠骨髓源性EPCs，為下一步實(shí)驗(yàn)研究作準(zhǔn)備。
　　 方法：Ficoll密度梯度離

3、心法獲取SD大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞，體外加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基EGM-2MV（含5％胎牛血清、VEGF10μg/L、bFGF2μg/L、EGF5μg/L）中，37℃溫箱中培養(yǎng)。（CD31、Ⅷ因子、CD34）免疫組織化學(xué)染色鑒定EPCs表面標(biāo)志，聯(lián)合FITC-UEA-1表面附著、Dil-acLDL內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定EPCs及細(xì)胞活力。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)EPCs特有的條索狀和鋪路石狀，細(xì)胞生長穩(wěn)定，3d時(shí)即可良好貼壁，培養(yǎng)10d時(shí)細(xì)

4、胞形態(tài)規(guī)整；經(jīng)CD31免疫組化染色鑒定，顯示EPCs表面CD31、Ⅷ因子、CD34表達(dá)陽性率分別為76±4.83％、71±5.55％和72±5.45％；FITC-LJEA-1表面附著、Dil-acLDL內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活力良好。
　　 結(jié)論：利用密度梯度離心法獲取大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs簡單可行，培養(yǎng)的細(xì)胞可充分表達(dá)EPCs表面標(biāo)志，并具有EPCs的功能特征。
　　 關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞、培養(yǎng)、鑒定、表面標(biāo)

5、志；
　　 第二部分：EPC移植治療對腎臟IRI的保護(hù)作用觀察
　　 目的：建立大鼠腎臟急性IRI模型，觀察EPCs移植對急性IRI腎臟的保護(hù)作用。
　　 方法：9只成年雄性SD大鼠，體重180±20g，分如下幾組進(jìn)行研究（n=3）：①假手術(shù)組（sham組）：腹部正中切口，分離左腎動(dòng)、靜脈后關(guān)腹；②缺血再灌注組（IRI組）：腹部正中切口，分離左腎動(dòng)、靜脈后，利用血管鉗同時(shí)夾閉腎臟動(dòng)、靜脈25min后關(guān)腹：③EPC

6、s移植組（EPCs組）：按照②建立大鼠腎臟IRI模型后，從大鼠股靜脈注射EPCs混懸液（1×106個(gè)）。模型制作成功后，分別于術(shù)后24h、72h抽取大鼠外周血；術(shù)后72h，處死大鼠，留取缺血腎臟組織，一分為四，兩份采用多聚甲醛固定，行HE染色和CD34免疫組化染色，另兩份新鮮組織標(biāo)本送-80℃冰箱保存，檢測VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①術(shù)后24h，大鼠外周血BUN表達(dá)水平，IRI組、EPCs移植組較sham組

7、均明顯升高（P<0.05）；術(shù)后72h時(shí)，IRI組較sham組差異仍存在，EPCs移植組與sham組差異消失。術(shù)后24h，大鼠外周血Cr表達(dá)水平，EPCs移植組較sham組、IRI組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后72h，EPCs移植組Cr下降明顯（P<0.05）。②HE染色，sham組腎臟組織微結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，IRI組腎臟病理損傷程度較重，EPCs移植組腎臟病理損傷程度優(yōu)于IRI組。③術(shù)后72h，缺血腎組織中CD34多表達(dá)于腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞

8、胞膜上，其中EPCs移植組CD34+細(xì)胞數(shù)目明顯增多。④術(shù)后72h，缺血腎組織中VEGFmRNA表達(dá)水平，EPCs移植組最高，分別是sham組、IRI組的1.25倍和1.62倍；此結(jié)果與蛋白水平檢測情況相仿（P<0.05）。
　　 結(jié)論：通過夾閉大鼠腎蒂的方法，可成功制作大鼠急性IRI模型。EPCs參與了腎臟IRI后損傷血管內(nèi)皮的的修復(fù)和重建，外源性EPCs移植可促進(jìn)IRI腎臟功能恢復(fù)。EPCs對損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)可能與其定向歸