內(nèi)皮祖細(xì)胞減輕大鼠腦缺血再灌注損傷及相關(guān)機制的研究.pdf

1、前言：
　　腦卒中目前是臨床常見病、多發(fā)病，是目前三大致死疾病之一、是首位致殘因素，且在我國其發(fā)病率、病死率及致殘率有逐年上升的趨勢，其中缺血性腦血管病占絕大部分。缺血性腦血管病尤其是腦缺血后的再灌注損傷，危害極大。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細(xì)胞損傷，恢復(fù)血液再灌注后，其缺血性損傷反而進一步加重的現(xiàn)象。研究表明，線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、氧自由基激活及炎癥反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)。然而，目前尚缺乏有效的治療手段。因

2、此，尋找新的腦缺血再灌注損傷的治療方法，對于減輕腦缺血后的再灌注損傷，降低其致死率具有重要意義。
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一種來源于骨髓的前體細(xì)胞，能增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，也稱為成血管細(xì)胞(angioblast)，在內(nèi)源性因素，外源性細(xì)胞因子，藥物等因素的刺激下，EPCs可以從骨髓中動員進外周血參與出生后缺血組織的血管發(fā)生和血管損傷后的修復(fù)。近年來，基于內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞治療手段在治療高血壓、糖尿病、冠心病、腦卒中等方面

3、的應(yīng)用正日益受到關(guān)注。其中Ohta(2006)等人發(fā)現(xiàn)通過靜脈注射經(jīng)體外擴增的骨髓來源的EPCs可以顯著減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。然而，EPCs對腦缺血再灌注損傷的相關(guān)生物學(xué)機制仍不十分清楚，有待于進一步研究。
　　目的：
　　為了觀察移植骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞能否減少缺血再灌注損傷模型大鼠腦梗死容積，減少再灌注損傷所造成的神經(jīng)功能損害，并研究其可能的腦保護機理，與抑制缺血再灌注后細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激以及對核因子-κB表達(dá)水平變

4、化的關(guān)系，以探討內(nèi)皮祖細(xì)胞對腦梗死潛在治療作用及其相關(guān)機制。
　　材料和方法：
　　1、EPCs的制備:SD大鼠經(jīng)常規(guī)麻醉后取股骨及脛骨，淋巴細(xì)胞分離液沖洗骨髓，密度梯度離心分離單個核細(xì)胞，置于EGM-2MV培養(yǎng)液中培養(yǎng)，，顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)第六天加CM-Dil。培養(yǎng)第一天和第十天時流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞標(biāo)志物CD31、CD34、CD133、KDR表達(dá)陽性的細(xì)胞比例。培養(yǎng)第十天加DAPI備用。
　　2、線栓

5、法腦缺再灌注動物模型的建立:40只大鼠將SD大鼠麻醉，分為假手術(shù)組(sham)，模型組(IR)和治療組(ADSC)，IR和ADSC組，實驗大鼠采用線栓法大腦中動脈腦缺血再灌模型(MCAO)建立局灶性腦缺血再灌動物模型。缺血2h后再灌注，ADSC組再灌注0和12小時時通過靜脈注射1.0-2.0×106個(0.5ml)經(jīng)CM-Dil標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞，IR組注射等體積生理鹽水。
　　3、形態(tài)學(xué)檢查:將各組中的腦組織經(jīng)TTC(2，3，5—

6、氯化三苯基四氮唑)染色，計算腦梗塞面積。
　　4、遷移檢查:取缺血部分腦組織，熒光顯微鏡下觀察是否有pkh26標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　5、腦組織中NF-κB表達(dá)檢測:免疫組織化學(xué)染色，real-time PCR，western blot檢測各組腦組織中NF-κB的表達(dá)水平。
　　6、抗氧化檢測:試劑盒方法檢測SOD，GSH，GSH-PX和MDA的活性。
　　7、凋亡檢測:試劑盒方法檢測各組大鼠腦組織中caspas

7、e-3的活性。western blot檢測缺血腦組織中bcl-2和bax的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、經(jīng)10天培養(yǎng)后獲得了細(xì)胞呈紡錘形的細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞檢測CD33+46.81％，CD34+70.83％，CD133+81.66％，flk-160.5％，達(dá)到作為實驗治療的要求。
　　2、EPCs的治療組缺血再灌注模型大鼠的的神經(jīng)功能損害較對照組顯著減低(P＜0.01)，ADSC腦梗死容積(76.76±8.19mm3)

8、，小于IR組梗死容積(143.39±8.23mm3)(P＜0.01)，通過熒光共聚焦檢查發(fā)現(xiàn)在腦缺血區(qū)域有經(jīng)pkh26標(biāo)記的EPCs存在，表明靜脈注射的EPCs可趨化、遷移至梗死區(qū)域。
　　3、NF-κB免疫組化染色表現(xiàn)為在光鏡下觀察為細(xì)胞胞核染色，呈棕黃色。sham組有零星凋亡細(xì)胞，IR組鏡下可見大量核染色的凋亡細(xì)胞圍繞在條形、環(huán)形或斑片狀壞死中心，并且在western blot、免疫熒光檢測EPCs治療組NF-κB表達(dá)均明顯低

9、于對照組(P＜0.05)。
　　4、EPCs治療組大鼠腦缺血區(qū)域MDA水平明顯低于對照組(P＜0.05)，而SOD、GSH以及GSH-PX水平較對照組提高(P＜0.05)。
　　5、EPCs治療組大鼠腦組織caspase-3活性降低，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、EPCs的移植后能夠有效的減少腦組織梗死面積，減低缺血再灌注所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺失。
　　2、EPCs的