內(nèi)皮祖細胞外泌體對大鼠球囊損傷血管再內(nèi)皮化的作用及機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　血管內(nèi)膜損傷以及損傷后修復過程緩慢是多種介入術(shù)后再狹窄病理生理基礎，如下肢動脈球囊擴張術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈支架置入術(shù)等。血管內(nèi)膜的破壞，增加血管感染、脂質(zhì)沉淀、血栓形成的風險，導致內(nèi)膜病理性增厚及血管壁重塑，最終導致血管狹窄形成。由此可見，加速損傷血管的早期的再內(nèi)皮化，在避免術(shù)后再狹窄形成中有著重要的作用。
　　內(nèi)皮祖細胞是內(nèi)皮細胞的前體細胞，多項體內(nèi)外的研究證明其可促進損傷后的血管內(nèi)膜修復，經(jīng)典的理論認為

2、其機制有如下兩方面，一是直接分化為成熟的血管內(nèi)皮細胞，二是增加殘存的內(nèi)皮細胞的增殖及遷移能力以促進內(nèi)膜新生。近年來，多項實驗研究顯示，內(nèi)皮祖細胞促進內(nèi)膜新生主要是其通過分泌多種遺傳物質(zhì)、細胞因子等旁分泌途徑促進殘留的血管內(nèi)皮細胞的增生，而內(nèi)皮祖細胞直接分化為成熟的血管內(nèi)皮細胞是微不足道的。外泌體是一種直徑為40-100納米的圓形或橢圓形膜性結(jié)構(gòu)，是旁分泌機制的重要成分，通過轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNAs等物質(zhì)在細胞間通訊中起著重要作用。最近

3、有研究證實，從間充質(zhì)干細胞及心肌前體細胞來源的外泌體，可以觸發(fā)血管新生和恢復局部受損組織功能，這說明外泌體在干細胞的旁分泌機制中扮演重要角色。基于以上理論，我們推定內(nèi)皮祖細胞在促進血管內(nèi)膜損傷后的修復中，外泌體參與的旁分泌機制起著重要作用。
　　本實驗中，我們首先從人類臍帶血中分離純化內(nèi)皮祖細胞，隨后從內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)液中提取外泌體；動物實驗部分，我們成功制作大鼠頸動脈球囊損傷模型，然后通過鼠尾靜脈注射外泌體，觀察其對血管再內(nèi)皮化

4、及內(nèi)膜增生的作用；機制研究部分，我們著重研究內(nèi)皮祖細胞來源的外泌體對血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、成管等功能的影響，通過qRT-PCR探討外泌體對血管新生相關(guān)基因的表達的影響。
　　實驗方法:
　　1.內(nèi)皮祖細胞及其來源的外泌體的分離及鑒定
　　1.1密度梯度離心法分離誘導內(nèi)皮祖細胞：人類臍帶血稀釋后平鋪于人淋巴細胞分離液Histopaque1077，取中間白膜層即為單個核細胞，培養(yǎng)皿用鼠尾膠原包被，培養(yǎng)于特殊的EGM-2

5、 MV誘導培養(yǎng)液中。
　　1.2選取培養(yǎng)培養(yǎng)至2-3代的EPCs進行鑒定，免疫熒光檢測細胞表面特異性蛋白vWF、CD31和CD34表達。
　　1.3利用流式細胞分析技術(shù)分別檢測CD31、CD34、CD133、CD144、CD146和CD45在細胞表面的表達。
　　1.4熒光檢測內(nèi)皮祖細胞攝取乙?；兔芏戎鞍滓约敖Y(jié)合荊豆凝集素。
　　1.5內(nèi)皮祖細胞在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時，用超速離心法提取培養(yǎng)液中的外泌體

6、，BCA法檢測其蛋白濃度。
　　1.6在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)、直徑等。
　　1.7 Western Blotting檢測，人類臍帶血來源的內(nèi)皮祖細胞外泌體是否表達進化保守蛋白CD9、CD63和CD81。
　　2. EPC-Exo對大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷后的修復作用
　　2.1大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立
　　2.2伊文氏藍染色來觀察EPC-Exo對損傷血管第14天及21天再內(nèi)皮化的作用，無內(nèi)皮細胞處被伊文

7、氏藍染成藍色，有內(nèi)皮覆蓋則不能被染色，選用再內(nèi)皮化面積/動脈總面積這一比值作為評價參數(shù)。
　　2.3通過HE染色，石蠟切片后，計算血管內(nèi)膜和中膜橫斷面的面積以及內(nèi)中膜面積比，來檢測外泌體對大鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增生的影響。
　　3.體外檢測EPC-Exo對內(nèi)皮細胞功能的影響及其機制
　　3.1熒光顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞對熒光標記的外泌體的吸收作用。
　　3.2 CCK8法檢測外泌體對內(nèi)皮細胞增殖作用的影響。
　　

8、3.3劃痕試驗檢測外泌體對內(nèi)皮細胞遷移能力的影響。
　　3.4 Metrigel法檢測外泌體對內(nèi)皮細胞成管作用的影響。
　　3.5 qRT-PCR法檢測外泌體對內(nèi)皮細胞表達血管新生相關(guān)基因的影響。
　　實驗結(jié)果:
　　1.成功分離獲取內(nèi)皮祖細胞及外泌體
　　1.1臍帶血分離誘導的細胞培養(yǎng)4天后，細胞培養(yǎng)板中可見橢圓形或梭形的貼壁細胞；繼續(xù)培養(yǎng)至第7-10天，梭形的細胞逐漸消失，其余貼壁細胞呈圓形，可見典型的

9、內(nèi)皮細胞樣集落形成；培養(yǎng)14-21天后，各集落融合，細胞呈鵝卵石樣。
　　1.2免疫熒光檢測細胞表面EPCs特異性蛋白vWF、CD31和CD34表達，>90%細胞呈陽性。
　　1.3利用流式細胞分析技術(shù)檢測，結(jié)果顯示CD31、CD34、CD133、CD144及CD146在培養(yǎng)細胞中的陽性率分別為98.16%、87.81%、79.14%、97.32%和94.16%，CD45的陽性率為0.2%，可以認為本實驗獲得純度較高的EPC

10、s
　　1.4熒光顯微鏡觀察顯示內(nèi)皮祖細胞能夠攝取乙?；兔芏戎鞍准敖Y(jié)合荊豆凝集素，且大多數(shù)細胞呈雙陽性。
　　1.5通過高速離心法，從無血清的內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)中成功提取到外泌體，使用BAC法定量樣品蛋白濃度為(200±60)μg/ml。
　　1.6在透射電鏡下觀察，可見外泌體呈圓形或橢圓形，直徑大小為30-100nm。
　　1.7 Western Blotting結(jié)果顯示，人類臍帶血來源的內(nèi)皮祖細胞外泌體表達進

11、化保守蛋白CD9、CD63和CD81。
　　2.外泌體對球囊損傷血管再內(nèi)皮化及內(nèi)膜形成的影響
　　2.1本實驗通過伊文氏藍染色來觀察外泌體對損傷血管第14天及21天再內(nèi)皮化的作用，選用再內(nèi)皮化面積/動脈總面積這一比值作為評價參數(shù)。實驗組和對照組大鼠，在術(shù)后第14天時有明顯的統(tǒng)計學差異(87.66±12.3%vs.53.37±10.3%;n=8;P<0.05)，說明EPC-Exo可促進損傷血管在早期的再內(nèi)皮化，但在第21天時并

12、無明顯統(tǒng)計學差異(90.65±12.1%vs.92.42±11.6%;n=8;P<0.05)。
　　2.2本實驗使用Leica Qwin圖像分析軟件，計算血管內(nèi)膜和中膜橫斷面的面積以及內(nèi)中膜面積比，來檢測外泌體對大鼠頸動脈損傷后內(nèi)膜增生的影響。實驗組和對照組大鼠，在術(shù)后第14天時有明顯的統(tǒng)計學差異(0.282±0.11 vs.0.587±0.10;n=8;P<0.05)，說明外泌體可抑制被損傷血管在早期的內(nèi)膜增生，但在第21天時并

13、無明顯統(tǒng)計學差異(0.885±0.33 vs.1.245±0.17;n=8;P<0.05)。
　　3.外泌體促進內(nèi)皮細胞功能
　　3.1免疫熒光結(jié)果顯示，內(nèi)皮細胞使用含綠色熒光Dio標記的EPC-Exo的培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時后，可見熒光顆粒聚集于DAPI染色的細胞核周圍，說明內(nèi)皮細胞能夠內(nèi)吞外泌體進入細胞內(nèi)。
　　3.2 CCK8法結(jié)果顯示：對照組內(nèi)內(nèi)皮細胞增殖緩慢，而外泌體干預組內(nèi)的內(nèi)細胞增殖速度較快，曲線較為陡直。比較

14、各時間點兩組的吸光度值可見，從第2天開始，實驗組的吸光度值較對照組的吸光度值即有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　3.3劃痕實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)8小時后，外泌體干預組的內(nèi)皮細胞的遷移指數(shù)為0.612±0.033，而對照組為0.336±0.028，統(tǒng)計結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本實驗表明外泌體可以顯著促進內(nèi)皮細胞遷移。
　　3.4 Matrigel法檢測結(jié)果顯示：4小時后，對照組和外泌體干預組均可見管樣結(jié)構(gòu)，管長

15、分別為9.554±1.672mm和15.131±1.833mm，分支數(shù)分別為38.615±3.293和51.984±4.665，兩組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；8小時后，兩組的管長和分支數(shù)仍有統(tǒng)計學差異。
　　3.5內(nèi)皮細胞在含外泌體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，多種血管新生性基因(eNOS，IL-8，ANG-1，E-selectin，VEGFA，VEGFR-2，HIF-1a，CXCL16，PDGFA)表達成倍增加，與對照組有顯著統(tǒng)