雄激素調(diào)控小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管形成作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞在雄激素的干預(yù)下向新生毛細(xì)血管發(fā)生的作用機(jī)制，明確雄激素調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用靶點(diǎn)，為基于內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)心臟缺血性疾病的治療思路提供理論依據(jù)。
　　方法:首先分離、培養(yǎng)骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞，基于內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)體系EBM-2培養(yǎng)后獲取EPCs，采用DiI-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)、以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD31、CD34、CD11b、CD133、CD105、CD45，完成EPCs的細(xì)胞鑒定。通過將EPCs與人

2、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng)完成體外matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分別采用不同濃度梯度（0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L）的人工合成雄激素雙氫睪酮(DHT)預(yù)處理EPCs，進(jìn)而根據(jù)管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果獲取DHT的最適宜干預(yù)濃度為10 nmol/L。結(jié)合基因芯片技術(shù)、信號(hào)通路分析軟件篩選DHT干預(yù)下的EPCs各基因的表達(dá)差異。采用realtime PCR驗(yàn)證部分篩選出的異常表達(dá)基因，選定Ef

3、nb2為目的基因。構(gòu)建shRNA-Enfb2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，realtime PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后EPCs中Efnb2基因的表達(dá)水平。再次行matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為四組:①單純EPCs對(duì)照組、②10nmol/L DHT處理的EPCs組、③10nmol/LDHT+NC-shRNA處理EPCs組、④10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA處理EPCs組。通過評(píng)估管樣結(jié)構(gòu)中熒光標(biāo)記的EPCs數(shù)量評(píng)價(jià)各組

4、EPCs向血管新生的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制。最后基于小鼠下肢缺血模型的建立進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，體內(nèi)研究分為五組:①空白對(duì)照組、②單純EPCs移植組、③10nmol/L DHT處理的EPCs移植組、④10nmol/L DHT+NC-shRNA處理EPCs移植組、⑤10nmol/L DHT+Efnb2-shRNA處理EPCs移植組。各組動(dòng)物分別于術(shù)后第二天，在股總動(dòng)脈結(jié)扎處兩側(cè)、股深動(dòng)脈結(jié)扎處兩側(cè)及小腿腓腸肌處分別以微量注射針注射25μl各組EP

5、Cs細(xì)胞液行干預(yù)治療。下肢缺血手術(shù)后第7天、第14天（即EPCs注射后第5天、第12天）行下肢血流激光多普勒掃描評(píng)估下肢血流灌注水平。術(shù)后第14天處死小鼠，并獲取下肢肌肉組織標(biāo)本，通過免疫熒光判定EPCs存活量及新生毛細(xì)血管密度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以又士s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)方法，以P＜0.05視為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:成功從小鼠

6、長骨骨髓中分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，通過EBM-2培養(yǎng)基成功培養(yǎng)EPCs，流式細(xì)胞表面抗原檢測(cè)及DiI-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)均提示符合EPCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)。不同DHT濃度梯度干預(yù)EPCs后matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示最適宜DHT濃度為10 nmol/L。采用基因芯片檢測(cè)DHT干預(yù)后EPCs基因表達(dá)差異，再結(jié)合realtimePCR驗(yàn)證后初步篩選出11個(gè)異常表達(dá)基因:Egr1、Vcan、Fgf3、Cxcl10、Cxcl2、Hdac4

7、、Bmp7、Stfa2l1、Cldn1、Cdk2ap1、Efnb2。選取Efnb2為目的基因構(gòu)建Efnb2-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)EPCs后觀察熒光信號(hào)以及realtime PCR驗(yàn)證基因抑制水平，提示成功獲取穩(wěn)轉(zhuǎn)的Efnb2-shRNA-EPCs，可用于進(jìn)一步研究。體外研究中經(jīng)DHT預(yù)處理各組EPCs進(jìn)行matrigel管樣結(jié)構(gòu)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示相較單純DHT處理組，同時(shí)經(jīng)Efnb2-shRNA干預(yù)可顯著削弱EPCs血管樣

8、分化的能力，提示Efnb2極有可能是DHT調(diào)控EPCs生物學(xué)行為的重要靶基因位點(diǎn)之一。體內(nèi)研究成功構(gòu)建小鼠下肢缺血模型，在進(jìn)行各組細(xì)胞干預(yù)之后，激光多普勒結(jié)果提示10nmol/LDHT處理的EPCs移植組和10nmol/L DHT+NC-shRNA處理EPCs移植組均可獲得顯著的下肢血運(yùn)重建效果，而攜帶Efnb2-shRNA的EPCs未能表現(xiàn)出理想的血管再生功能。此外lectin熒光染色（提示血管生成）和GFP+（EPCs示蹤）也表現(xiàn)出