內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在膠質(zhì)瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性形成中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、惡性實(shí)體瘤(malignantsolidtumors)的生長和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤內(nèi)血管新生(neovascularization)。腫瘤血管新生機(jī)制涉及由原血管床成熟內(nèi)皮芽生的血管生成(angiogenesis)和由骨髓動(dòng)員的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell，EPCs)歸巢腫瘤原位分化、增殖而來的血管形成(vasculogenesis)。盡管血管生成機(jī)制和抗血管生成一直是近些年腫瘤研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，但抗腫瘤血管

2、生成治療效果不顯著。其根本原因可能是骨髓EPCs不僅參與血管形成，而且能整合瘤周內(nèi)芽生血管并形成不同內(nèi)皮細(xì)胞來源的混合性血管。 本課題組新近提出腫瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性(tumormicrovasculararchitecturephenotypeheterogeneity，T-MAPH)的概念，并認(rèn)為T-MAPH的存在是抗腫瘤血管生成治療障礙的關(guān)鍵因素。作為參與腫瘤新生血管的關(guān)鍵細(xì)胞，很少有人注意到EPCs在T-MAPH形成中

3、的作用及機(jī)制。人腦惡性膠質(zhì)瘤具有高血管生成活性，且微血管密度越高，患者預(yù)后越差，被認(rèn)為是研究T-MAPH的作用及機(jī)制的良好模型。 EPCs是從骨髓、臍血或外周血分離并具有CD34、VEGFR2和或CD133陽性標(biāo)志細(xì)胞，能夠在趨化因子和生長因子等刺激下募集并歸巢于腫瘤血管新生位點(diǎn)，原位分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與腫瘤血管形成。另外，EPCs不但參與腫瘤血管形成，而且還可以促進(jìn)由原微血管床芽生血管生成。并且越來越多的研究證實(shí)，EPCs參與

4、腫瘤的血管新生，在腫瘤生長中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，T-MAPH不僅表現(xiàn)在與正常血管的不同，而且還表現(xiàn)在不同腫瘤之間、同種腫瘤不同個(gè)體之間、同一腫瘤不同區(qū)域和發(fā)生演進(jìn)階段之間，腫瘤組織的微血管之間在密度、形態(tài)、結(jié)構(gòu)(組成)、三維分布上的差異性和多樣性。因此，作為參與腫瘤新生微血管的關(guān)鍵細(xì)胞，EPCs是否或如何與瘤內(nèi)原血管床的芽生成熟內(nèi)皮發(fā)生連接或吻合參與腫瘤微血管網(wǎng)以及這些血管網(wǎng)是否具有多樣性和異質(zhì)性，尚不清楚。 與

5、成熟內(nèi)皮細(xì)胞相比，EPCs高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，此受體的表達(dá)與活化在EPCs參與血管新生中可能具有重要作用。EPCs中CXCR4被其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal-cellderivedfactor-1，sDF-1)活化后通過G蛋白耦連受體介導(dǎo)EPCs參與血管新生。有研究者證實(shí)，SDF-1在募集骨髓nicheCXCR4+EPCs進(jìn)入新生血管活躍區(qū)原位分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管發(fā)生中起著主要作用。并且SDF-1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、

6、分化、芽生和管型形成及阻止EPCs凋亡。另外，研究者證實(shí)淋巴瘤患者尸檢淋巴組織整合血管內(nèi)的EPCs中CXCR4mRNA的表達(dá)高于循環(huán)EPCs中CXCR4mRNA水平，并且EPCs高表達(dá)CXCR4mRNA與腫瘤微血管密度和腫瘤體積成正相關(guān)。臨床前研究發(fā)現(xiàn)拮抗SDF-1/CXCR4信號(hào)可有效阻斷SDF-1促腫瘤血管新生作用。本課題組前期研究證明，CXCR4活化誘導(dǎo)VEGF和IL-8表達(dá)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤T-MAPH作用。但SDF-1/CXCR4軸

7、活化是否參與介導(dǎo)EPCs參與T-MAPH形成，尚缺乏研究。 為了解CXCR4活化后介導(dǎo)EPCs參與膠質(zhì)瘤T-MAPH的作用及機(jī)制，我們觀測了EPCs參與人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87裸鼠皮下移植瘤微血管構(gòu)筑表型，并對(duì)EPCs的CXCR4活化是否介導(dǎo)EPCs的遷移及其在膠質(zhì)瘤T-MAPH形成中的作用進(jìn)行探索。首先，我們觀測了從人臍血分離、鑒定的EPCs生物學(xué)特性，研究了在體外標(biāo)記并經(jīng)尾靜脈移植的EPCs歸巢于U87移植瘤內(nèi)參與T-MAP

8、H形成在微血管密度、形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)分布等方面的表現(xiàn)；最后，我們探討了EPCs中CXCR4活化介導(dǎo)EPCs遷移及其在膠質(zhì)瘤微血管表型形成中的作用，并觀測了CXCR4受體抑制劑AMD3100對(duì)SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)上述效應(yīng)的抑制作用。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.從人臍血中分離、鑒定的EPCs具有自我更新、可被誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性。 ①應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、密度梯度離心聯(lián)合專用培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果顯示，新

9、鮮分離的CBMCs中存在CD34+/CD133+細(xì)胞(1.06％)，在添加了生長因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4d后，CD34表達(dá)增加，CD133表達(dá)減少，CD34+/CD133+減少(0.26％)，由祖細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化。 ②免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，獲得的單核源性EPCs，可表達(dá)CD14CD34和KDR，吞噬DiI-Ac-LDL，并能連接FITC-UEA-1。另一類是晚期增殖性EPCs，在內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液中生長具有形成初級(jí)集落和次集集落能力

10、；CD133、CD34、KDR、vWF、CD31，DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1皆呈陽性表達(dá)。 ③Matrigel管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述兩亞型的EPCs在Matrigel中均可形成小管樣結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，從人臍血分離單個(gè)核細(xì)胞(CBMCs)經(jīng)內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的EPCs具有自我更新、誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性。 2.人源性EPCs特異地整合到膠質(zhì)瘤細(xì)胞異種移植瘤宿主源性新生微血管中，并形成

11、人-鼠嵌合性血管。將膜熒光染料CFSE標(biāo)記的EPCs經(jīng)鼠尾靜脈植入經(jīng)60Co亞致死劑量輻射后荷人U87細(xì)胞移植瘤的裸鼠體內(nèi)， ①免疫熒光染色顯示，遷移到U87裸鼠移植瘤內(nèi)CFSE+EPCs數(shù)量明顯高于肝脾組織(p＜0.01)。 ②免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)顯示，CFSE+EPCs以兩種形式參與血管新生：單個(gè)或成簇的EPCs散在分布于鼠源性的血管旁，形成盲端或功能性的血管；或與鼠源性血管連接整合形成人-鼠嵌合性微血管。定量結(jié)

12、果顯示EPCs參與形成的新生血管占總血管的113～18.6％。 ③免疫熒光染色結(jié)果顯示，CFSE+/CD31+EPCs與鼠源性CD31陽性的內(nèi)皮細(xì)胞組成的混合性血管形態(tài)表現(xiàn)多樣：或呈樹桿分支樣，或呈蛇形蜿蜒，或呈實(shí)性條索，或呈血竇狀。三維重建結(jié)果顯示，人源性CFSE+EPCs與鼠源性CD31+內(nèi)皮細(xì)胞相互連接和或吻合構(gòu)建成雜亂的人-鼠嵌合性新生微血管網(wǎng)，血管分支長短、大小和管壁厚薄不等。人源性CFSE+EPCs連接或聚集于鼠源性

13、血管分支處形成多層內(nèi)皮細(xì)胞的厚壁血管，鼠源性內(nèi)皮細(xì)胞組成薄壁血管。在上述微血管結(jié)構(gòu)中鼠源性內(nèi)皮細(xì)胞主要分布于血管主體，而CFSE+細(xì)胞分布于血管盲袢或新生血管分支點(diǎn)。應(yīng)用IPP圖形軟件定量分析CFSE+EPCs組成的血管段與人-鼠嵌合性新生微血管網(wǎng)的物理參數(shù)，結(jié)果顯示，CFSE+EPCs組成的血管段像素值約為總血管的(26±7)％，血管長度占總血管的(22±5)％，而血管分支點(diǎn)占總血管的(36±1)％。 ④人源性EPCs增強(qiáng)耐受

14、骨髓損傷的裸鼠膠質(zhì)瘤模型微血管密度(P＜0.01)，增加移植瘤幼稚微血管新生比例(P＜0.05)，且促進(jìn)了腫瘤生長(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，體外植入的EPCs特異地歸巢并整合于U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤新生血管位點(diǎn)，從形態(tài)、三維分布和MVD上體現(xiàn)了EPCs參與形成VT-MAPH，進(jìn)而促進(jìn)移植瘤生長。 3.SDF-1/CXCR4軸活化介導(dǎo)EPCs遷移并促進(jìn)EPCs參與膠質(zhì)瘤T-MAPH形成。 ①間接免疫熒光顯示，EPC

15、s表達(dá)SDF-1和CXCR4。 ②MTT結(jié)果顯示，不同濃度的SDF-1(9、19、37.5、75和150μg/L)在24、48和72h活化CXCR4后能明顯誘導(dǎo)EPCs增殖，各組平均吸光度值均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。CXCR4的小分子抑制劑ADM3100在24、48和72h能有效拮抗CXCR4活化介導(dǎo)的EPCs增殖作用(P＜0.05)。 ③遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，19μg/LSDF-1活化CXCR4后能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞

16、遷移(P＜0.05)。相/反，AMD3100能顯著拮抗CXCR4活化對(duì)EPCs的遷移作用(P＜0.05)。 ④Matrigel管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示，EPCs表達(dá)的CXCR4活化后EPCs形成小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)為16.3±2.2。AMD3100能明顯減少EPCs小管樣結(jié)構(gòu)形成，平均數(shù)為6.4±1.8。 ⑤植入EPCs的移植瘤組織SDF-1和VEGF表達(dá)量顯著高于未植入EPCs(即對(duì)照組)的移植瘤組織(P＜0.05)。SDF-1和

17、VEGF表達(dá)量與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，EPCs可通過自分泌或旁分泌作用活化CXCR4進(jìn)而介導(dǎo)EPCs增殖、遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成并參與T-MAPH形成。而AMD3100具有抑制SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)的上述效應(yīng)的作用。 綜上所述，本研究從人臍血中分離、鑒定出的EPCs具有自我更新、誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性，植入的人源性EPCs能特異地歸巢到U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤內(nèi)新生血管位點(diǎn)，通過連接或整合瘤內(nèi)成熟