基于克隆異質(zhì)性篩選和鑒定人膠質(zhì)瘤干細胞及其機制的初步研究.pdf

1、腫瘤具有明顯的異質(zhì)性。腫瘤實質(zhì)中，不同腫瘤細胞群體在增殖能力、分化程度、侵襲能力以及治療抵抗性等多方面存在差異。在體外培養(yǎng)條件下，腫瘤細胞的克隆形成能力也存在異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在體內(nèi)可能表現(xiàn)為不同腫瘤細胞在成瘤能力上的差異。根據(jù)成瘤能力的差異，可以將腫瘤細胞分為不同的亞群，那部分具有高度成瘤能力的腫瘤細胞被稱為腫瘤干細胞(tumorstemcells，TSCs)或癌癥干細胞(cancerstemcells，CSCs)，CSCs可分化形成

2、大量無腫瘤形成能力的腫瘤細胞，即非成瘤性腫瘤細胞(non-tumorigeniccancercells)。迄今為止，腫瘤干細胞在造血系統(tǒng)腫瘤以及多種實體瘤內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和證實，這部分細胞雖然為數(shù)極少，卻可以自我更新(復(fù)制)和無限增殖，被認為是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的根源。 膠質(zhì)瘤是一類異質(zhì)性十分顯著的腫瘤。已經(jīng)有較多的證據(jù)表明膠質(zhì)瘤存在腫瘤干細胞即膠質(zhì)瘤干細胞(Gliomastemcells，GSCs)。盡管膠質(zhì)瘤干細胞的研究正在不

3、斷取得進展，但膠質(zhì)瘤干細胞的分選仍是這一領(lǐng)域乃至腫瘤干細胞領(lǐng)域的一個基本而關(guān)鍵的問題。目前GSCs的分離或富集采用的方法多是利用流式細胞術(shù)或免疫磁珠技術(shù)對膠質(zhì)瘤內(nèi)的CD133+細胞進行分選，因為CD133+細胞經(jīng)證實具有腫瘤干細胞的特性。另一種常用的方法則是根據(jù)干細胞高表達ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運體的特點，通過流式細胞術(shù)從膠質(zhì)瘤內(nèi)分離出“側(cè)亞群”(sidepopulation，SP)細胞，由于SP細胞經(jīng)

4、證實具有腫瘤干細胞的特性，因此篩選SP細胞也可以達到分選或富集腫瘤干細胞的目的。上述兩種方法不僅需要一定的設(shè)備，對細胞的活力也有影響，而且敏感性和特異性也存有疑問。因此，尋找新的GSCs分選策略或方法十分必要。 由于腫瘤干細胞與非成瘤性腫瘤細胞在分化程度、增殖能力上存在差異，所以體外培養(yǎng)時兩者的克隆形成能力可能也會不同，并可能形成不同表型的克隆。有研究報道，頭頸部鱗癌、乳腺癌以及前列腺癌細胞形成的克隆具有形態(tài)異質(zhì)性，其中的一類形

5、態(tài)規(guī)則緊密的克隆含有腫瘤干細胞，其成瘤能力很強，少至100個細胞即可在動物體內(nèi)形成移植瘤，而其他類型的克隆無成瘤能力。因此，細胞克隆的異質(zhì)性尤其是形態(tài)上的異質(zhì)性可能有助于對腫瘤干細胞進行分選或富集。這種方法操作較簡單，而且比較符合腫瘤干細胞的功能定義，為獲得腫瘤干細胞提供了新的思路。但在膠質(zhì)瘤是否存在克隆異質(zhì)性，以及這種異質(zhì)性是否可用于對GSCs的識別和分選，目前還未見文獻報道，而且利用克隆形態(tài)的異質(zhì)性對含有腫瘤干細胞克隆進行識別和分選

6、的機制還從未被闡明。 為解決上述問題，本研究以人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U251為模型，觀測其克隆異質(zhì)性并進行分類，初步篩選鑒定出GSCs克隆，并部分闡明了利用克隆形態(tài)異質(zhì)性識別腫瘤干細胞克隆的機制。另外，我們還觀測了人間變性星形少突膠質(zhì)瘤的GSCs在動物體內(nèi)的成瘤能力和分化特性，鑒定了其腫瘤干細胞特性。本研究共分為三個部分： 第一部分，觀測了U251細胞克隆形態(tài)及分化的異質(zhì)性。本部分進行了U251細胞的克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)其克隆

7、形成率為7.88％。根據(jù)克隆形態(tài)將其分為緊密型，中間型和松散型三類。三種類型的克隆所占比例分別為11.9％，61.0％和27.1％。利用免疫細胞染色、激光共聚焦術(shù)觀察克隆三種分化標記物GFAP，vimentin及nestin表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)緊密型克隆GFAP表達最弱，vimentin，nestin的表達最強；松散型克隆GFAP表達最強，而vimentin，nestin表達最弱；中間型克隆上述三種標記物均有一定程度表達，居于緊密型和松散

8、型之間。 第二部分，分離和鑒定了U251細胞系內(nèi)GSCs克隆，探討不同克隆形態(tài)發(fā)生機制。本研究利用克隆柱對分化程度最低的緊密型克隆進行分離，將細胞低密度接種再次進行克隆形成實驗。結(jié)果顯示來自緊密型克隆的細胞能再次形成緊密型克隆，具有自我更新能力，而且緊密型克隆的細胞除能復(fù)制自身的克隆類型以外，還可產(chǎn)生中間型和松散型克??；將緊密型克隆細胞接種至干細胞培養(yǎng)基，可見其與神經(jīng)干細胞類似，能形成懸浮生長的細胞球，免疫細胞染色顯示細胞球表達

9、CD133；將緊密型克隆形成的細胞球接種至含血清的培養(yǎng)基2周后，細胞球貼壁并發(fā)生分化，產(chǎn)生的細胞能分別表達神經(jīng)系統(tǒng)三種細胞譜系的標志物GFAP、MBP和β-tubulinⅢ，而且部分細胞可同時表達GFAP和β-tubulinⅢ。本部分研究還通過損傷修復(fù)實驗，細胞遷移實驗比較了不同克隆內(nèi)細胞的遷移能力，并利用免疫化學染色顯示與遷移相關(guān)的細胞骨架微絲F-actin在細胞內(nèi)的分布和排列方式。結(jié)果顯示，來自緊密型克隆的細胞體外遷移能力低下，細胞

10、骨架發(fā)育幼稚，F(xiàn)-actin排列紊亂，極性不明顯，而來自松散型克隆的細胞在體外具有更強的遷移能力。另外，緊密型克隆CD44呈強陽性，其表達高于中間型和松散型克隆，提示CD44可能是緊密型克隆細胞侵襲能力較強的分子基礎(chǔ)之一。 第三部分，觀察了人原發(fā)性間變性少突.星形細胞瘤GSCs在動物體內(nèi)的成瘤能力。本部分利用從原代培養(yǎng)的人間變性少突-星形細胞瘤細胞中分離獲得的GSCs進行異種移植，證明這些GSCs在體內(nèi)成瘤后發(fā)生異質(zhì)性分化，再現(xiàn)

11、了混合性膠質(zhì)瘤的生物學特性，并富含未分化細胞。 以上三部分研究提示： 1.U251細胞形成的克隆在形態(tài)和分化程度上具有異質(zhì)性，存在緊密型、中間型、松散型三類克隆，其中緊密型克隆的分化程度最低。 2.來自緊密型克隆的細胞具有自我更新、多向分化能力等腫瘤干細胞的特性；其體外遷移能力低下可能是此型克隆形態(tài)發(fā)生的重要機制之一。 3.GSCs經(jīng)異種移植成瘤后形成異質(zhì)性分化的膠質(zhì)瘤細胞，并富含未分化細胞。 綜