雄激素-雄激素受體軸調(diào)控Nanog基因?qū)δ[瘤細(xì)胞干性影響及機(jī)制研究.pdf

1、雄激素/雄激素受體信號(hào)軸作為一普遍存在于人體細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，除起到促進(jìn)男性發(fā)育與性征維持的關(guān)鍵作用外，也參與了細(xì)胞代謝與免疫調(diào)節(jié)等生理過程。此外，越來越多的研究證實(shí)，其還對(duì)細(xì)胞的增殖，凋亡等生命活動(dòng)過程起到了廣泛的調(diào)控作用。但同時(shí)，也因其具有上述廣泛高效的調(diào)控作用，雄激素信號(hào)軸在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色長(zhǎng)期以來被眾多研究所關(guān)注。
　　前期，在腫瘤研究中，因雄激素信號(hào)軸本身作為與男性生理調(diào)節(jié)密切相關(guān)的信號(hào)通路，一直以來大量的研究

2、主要集中于男性生殖系統(tǒng)腫瘤例如前列腺癌中。但隨著研究的深入，越來越多與激素相關(guān)的腫瘤被發(fā)現(xiàn)與其存在密切聯(lián)系。這其中，卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，之前的研究較少將其與雄激素關(guān)聯(lián)，但作為重要的性激素合成與分泌器官，其組織中除存在大量的雌孕激素外，還存在高水平的雄激素，而近年來，雄激素/雄激素受體軸與卵巢癌發(fā)生發(fā)展間的關(guān)聯(lián)被不斷認(rèn)識(shí)與探索。而另一比較特殊的腫瘤——肝癌，其發(fā)生率存在明顯的性別偏倚，即全世界范圍內(nèi)，在排除環(huán)境及生活習(xí)慣等外在

3、因素影響的情況下，男性的發(fā)病率也明顯高于女性。雖然肝臟作為人體重要的代謝器官并不直接參與性激素的合成，但其是性激素代謝的重要場(chǎng)所，其微環(huán)境中雄激素水平也較一般非性腺組織高。
　　目前，卵巢癌患者5年生存率僅為40％，死亡率高居?jì)D科腫瘤之首，其不良預(yù)后與卵巢癌細(xì)胞的耐藥、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但該過程中的具體原因尚不完全清楚;與此同時(shí)，肝癌作為惡性程度較高的腫瘤，其5年生存率在所有腫瘤中也處于較低水平。因此對(duì)卵巢癌和肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)影響因

4、素及機(jī)制的研究有著重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。而兩者與雄激素之間的關(guān)聯(lián)，使得我們對(duì)雄激素/雄激素受體軸在卵巢癌及肝癌等性激素相關(guān)性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的共性作用產(chǎn)生興趣。
　　近年來，隨著對(duì)腫瘤生物學(xué)行為和特征的不斷認(rèn)識(shí)，眾多研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)在腫瘤各階段的進(jìn)程中扮演了十分關(guān)鍵的角色，其通過不斷的自我更新及有效地抵抗外來損害等機(jī)制，成為腫瘤發(fā)生、耐藥及復(fù)發(fā)等環(huán)節(jié)的關(guān)鍵因素。而腫瘤干細(xì)胞存在一

5、個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過程，在腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，其內(nèi)的干細(xì)胞也面臨分化的壓力;同時(shí)，一部分非腫瘤干細(xì)胞在各種因素影響下又可以逆分化為具有腫瘤干細(xì)胞樣特征的細(xì)胞。因此，調(diào)控腫瘤細(xì)胞干性的相關(guān)因素及機(jī)制成為目前抗腫瘤研究的重點(diǎn)之一。
　　介于雄激素信號(hào)軸與卵巢癌及肝癌等激素相關(guān)性腫瘤間的關(guān)聯(lián)，以及腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要地位，我們對(duì)雄激素/雄激素信號(hào)軸是否參與惡性腫瘤細(xì)胞的干性調(diào)控產(chǎn)生了興趣。本課題組前期研究證實(shí)干性基因Nanog可以作為

6、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記，并在腫瘤細(xì)胞的干性調(diào)控中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用;而另一方面，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道雄激素受體能夠促進(jìn)Nanog基因的表達(dá)。所以，結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)，本課題中，我們對(duì)雄激素/雄激素受體信號(hào)軸對(duì)腫瘤細(xì)胞干性的影響，及其作用背后的相關(guān)機(jī)制等問題進(jìn)行了探討與研究。
　　本文主要的研究方法及結(jié)論如下:
　　1.證實(shí)在卵巢癌及肝癌組織中雄激素受體(androgen receptor，AR)存在異常高表達(dá)，且其表達(dá)與腫瘤干性標(biāo)

7、記Nanog間存在關(guān)聯(lián)
　　(1).證實(shí)了AR在卵巢癌及肝癌組織較對(duì)應(yīng)的正常組織明顯高表達(dá)。通過對(duì)卵巢癌及肝癌臨床組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測(cè)證實(shí):AR在卵巢癌及肝癌組織中表達(dá)較對(duì)應(yīng)的正常組織明顯增高。(2).AR與Nanog表達(dá)在腫瘤組織中存在相關(guān)性。通過Western blot，我們進(jìn)而檢測(cè)了Nanog的表達(dá)量，其在腫瘤組織中也較正常組織高表達(dá)。通過皮爾森相關(guān)性分析證實(shí)，AR與Nanog在腫瘤組織

8、中的表達(dá)存在相關(guān)性。
　　2.通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建內(nèi)源性Nanog基因標(biāo)記細(xì)胞模型，證實(shí)AR與Nanog在細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)一致且存在共定位。
　　(1).通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建內(nèi)源性Naong基因標(biāo)記細(xì)胞模型。首先，進(jìn)行g(shù)RNA設(shè)計(jì)和利用BbSI酶切構(gòu)建了Nanog基因CRISPR/Cas9+gRNA打靶載體;同時(shí)，采用PCR，限制性核酸內(nèi)切酶酶切及Gibson克隆等方法構(gòu)建了Nanog-2A-GFP

9、重組同源臂質(zhì)粒。通過對(duì)卵巢癌及肝癌細(xì)胞系分別同時(shí)轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒，我們利用細(xì)胞自身的同源重組修復(fù)機(jī)制將GFP綠色熒光蛋白編碼基因重組入了Nanog編碼區(qū)的后方，并通過流式細(xì)胞分選GFP陽性單克隆細(xì)胞進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)而進(jìn)行PCR，酶切及測(cè)序鑒定，篩選了打靶正確的GFP標(biāo)記Nanog單克隆細(xì)胞株。(2).檢測(cè)Nanog基因打靶細(xì)胞不同細(xì)胞亞型生物學(xué)功能差異。首先，通過流式細(xì)胞分選同株細(xì)胞中GFP(+)及(-)細(xì)胞，并經(jīng)過RT-PCR及

10、Western blot檢測(cè)證實(shí)，在GFP(+)細(xì)胞中，Nanog基因表達(dá)在mRNA及蛋白水平都明顯高于GFP(-)細(xì)胞;其次，通過體外細(xì)胞成球及克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)GFP(+)細(xì)胞成球及克隆形成等干性指標(biāo)較GFP（-）明顯增高;最后通過小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)GFP(+)細(xì)胞的腫瘤形成能力明顯高于GFP（-）細(xì)胞。(3).在單克隆細(xì)胞株中證實(shí)AR與Nanog表達(dá)存在一致性，且兩者在細(xì)胞中存在共定位。通過RT-PCR及Western bl

11、ot檢測(cè)證實(shí)了AR與Nanog在細(xì)胞中的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平都具有一致性，且都在GFP(+)細(xì)胞表達(dá)高于GFP(-)細(xì)胞;進(jìn)而通過激光共聚焦對(duì)兩者進(jìn)行免疫熒光的共定位檢測(cè)，證實(shí)兩者在GFP(+)細(xì)胞中存在共定位而在GFP（-）中無表達(dá)。
　　3.揭示雄激素信號(hào)軸通過促進(jìn)Nanog基因表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞干性產(chǎn)生的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　(1).證實(shí)雄激素信號(hào)軸能夠調(diào)控Nanog基因表達(dá)。利用雙氫睪酮(DHT)刺激或者雄激素受體促降解

12、劑(ASC-J9)抑制雄激素信號(hào)軸的活性，通過RT-PCR及Westernblot檢測(cè)AR及Nanog基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化情況證實(shí)，在DHT刺激后細(xì)胞的AR與Nanog基因mRNA及蛋白表達(dá)都明顯增高，而DHT的該作用能夠被ASC-J9抑制。(2).證實(shí)雄激素信號(hào)軸能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞干性。通過DHT和(或)ASC-J9對(duì)GFP(+)及（-）細(xì)胞進(jìn)行處理，證實(shí)激活雄激素處理能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞的克隆形成及成球能力，而抑制該信號(hào)軸能

13、夠逆轉(zhuǎn)該作用。(3).證實(shí)雄激素信號(hào)軸對(duì)于腫瘤細(xì)胞干性的調(diào)控是通過Nanog介導(dǎo)的。通過慢病毒載體對(duì)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行Nanog基因過表達(dá)及敲低，建立Nanog過表達(dá)及敲低細(xì)胞系，進(jìn)而分別對(duì)Nanog敲低細(xì)胞株中進(jìn)行DHT處理和對(duì)Nanog過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行ASC-J9處理，檢測(cè)兩者的成球和克隆形成等干性指標(biāo)，結(jié)果顯示DHT不能增強(qiáng)Nanog敲低細(xì)胞株的干性，而ASC-J9對(duì)于Nanog過表達(dá)的細(xì)胞干性下調(diào)作用也不明顯。(5).證實(shí)AR能夠直

14、接結(jié)合Nanog啟動(dòng)子區(qū)，激活其啟動(dòng)子活性進(jìn)而上調(diào)其表達(dá)。首先，我們通過序列片段分析證實(shí)Nanog啟動(dòng)子上存在AR特異性結(jié)合序列，并通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)證實(shí)AR與Nanog啟動(dòng)子相應(yīng)區(qū)域的特異性結(jié)合能力。其次，通過構(gòu)建Nanog啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因慢病毒載體，并感染相應(yīng)細(xì)胞系，獲得了具有Nanog啟動(dòng)子活性報(bào)告系統(tǒng)的細(xì)胞株;進(jìn)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DHT和（或）ASC-J9處理后檢測(cè)其熒光素酶活性，證實(shí)AR與Nanog啟

15、動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能夠激活其轉(zhuǎn)錄活性。
　　4.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證雄激素/雄激素受體信號(hào)軸的促瘤作用
　　(1)構(gòu)建去勢(shì)裸鼠模型。通過摘除裸鼠雙側(cè)睪丸構(gòu)建去勢(shì)小鼠模型，進(jìn)而將該去勢(shì)小鼠分為去勢(shì)組和去勢(shì)補(bǔ)充雄激素治療組。(2).分組建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察統(tǒng)計(jì)未處理組，去勢(shì)組及去勢(shì)補(bǔ)充雄激素治療組后腫瘤生長(zhǎng)及體積，證實(shí)去勢(shì)組腫瘤體積較其他兩組明顯減小。(3).證實(shí)雄激素在體內(nèi)能夠促進(jìn)Nanog表達(dá)，且AR與Nanog在組織中存在共

16、定位。通過移植瘤連續(xù)切片免疫組化檢測(cè)證實(shí)未處理組及補(bǔ)充雄激素組切片中Nanog及AR明顯高表達(dá)，且兩者存在組織細(xì)胞共定位。
　　綜上，本研究的結(jié)論主要可歸納為:
　　1.AR在卵巢癌及肝癌組織及細(xì)胞中異常高表達(dá)，且與干性基因Nanog的表達(dá)存在一致趨勢(shì)，兩者表達(dá)也存在正相關(guān)關(guān)系。
　　2.雄激素信號(hào)軸能夠通過AR直接綁定Nanog啟動(dòng)子激活其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)Nanog基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞干性起到促進(jìn)作用，且Nano

17、g是該干性調(diào)控作用中的關(guān)鍵分子。
　　3.雄激素信號(hào)軸能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤及生長(zhǎng)。
　　綜上，本研究通過探討雄激素信號(hào)軸與卵巢癌及肝癌兩種激素關(guān)聯(lián)性較高的腫瘤間的作用，證實(shí)了雄激素信號(hào)軸能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞干性起到促進(jìn)作用，并通過研究該調(diào)控的相關(guān)機(jī)制，證實(shí)干性基因Nanog參與這一過程。本研究一方面豐富了雄激素信號(hào)軸與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的認(rèn)識(shí)，從腫瘤干細(xì)胞層面闡述了相關(guān)機(jī)制;另一方面也為卵巢癌和肝癌這類與性激素相關(guān)的腫瘤的治療提