缺血缺氧狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬變化及其對細(xì)胞存活和增殖的作用.pdf

1、目的: 研究EPCs(endothelial progenitor cells)在缺血缺氧狀態(tài)下的自噬變化，探討自噬在細(xì)胞存活和增殖中的作用。
　　方法: 用密度梯度離心法從人臍帶血中分離單形核細(xì)胞，用VEGFR-2、CD34、CD133抗體標(biāo)記后通過流式細(xì)胞儀(flowcytometry, FCM)分選VEGFR-2+CD34+和VEGFR-2+CD133+細(xì)胞，進(jìn)一步通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察VEGFR-2、CD34、CD133

2、在EPCs上的共表達(dá)，將分選出的EPCs在VEGF作用下誘導(dǎo)擴(kuò)增。建立大鼠心肌梗死模型，選擇3個(gè)部位即正常心肌、梗死周邊及梗死區(qū)心肌分別將FG（fibrin glue）承載的EPCs注射入心肌組織中。通過半薄切片觀察FG承載的EPCs在心肌組織中的分布，透射電鏡觀察不同部位移植的EPCs的自噬變化。為了明確自噬對細(xì)胞增殖和活性的影響，本研究用3-MA抑制EPCs自噬后，通過流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期，MTT法檢測細(xì)胞活性的變化;在檢測缺氧狀態(tài)

3、下細(xì)胞的自噬變化中，該研究在體外模擬缺氧微環(huán)境，將分選后的EPCs分為五組:對照組、缺氧1組、缺氧2組、缺氧3組和3-MA組，缺氧1、2、3組分別缺氧30 min、1h、2h，在3-MA組中，先用濃度為5 mmol/L的3-MA預(yù)處理細(xì)胞1h，然后缺氧1h。經(jīng)缺氧處理后，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR檢測各組細(xì)胞自噬基因Beclin-1的表達(dá)變化;結(jié)合LC3免疫細(xì)胞化學(xué)染色和MDC染色檢測自噬體及陽性細(xì)胞數(shù)目變化;用透射電鏡觀察自噬

4、前體、自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)特征，通過VLCDS圖像分析軟件測量各組細(xì)胞中自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積，對兩者比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及比較;經(jīng)溶酶體示蹤劑lysoSensorTMDND-189標(biāo)記溶酶體后檢測其數(shù)目變化。為了明確自噬對缺氧狀態(tài)下細(xì)胞存活的作用，本文采用AO/EB染色及流式細(xì)胞分析檢測自噬對缺氧狀態(tài)下細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果: 與移植于正常心肌的EPCs相比，移植到心梗周邊區(qū)心肌中的EPCs數(shù)量變化不明顯并且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)

5、少量自噬體，但移植到梗死區(qū)的EPCs數(shù)量明顯減少且細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬體，還可觀察到位于梗死區(qū)的EPCs出現(xiàn)壞死變化。在細(xì)胞增殖和活性的檢測中，觀察到與對照組相比，3-MA阻斷自噬后，EPCs的增殖指數(shù)下降，細(xì)胞活性降低。隨著缺氧時(shí)間的延長，自噬基因Beclin-1表達(dá)增強(qiáng)，含LC3或MDC標(biāo)記的自噬體及陽性細(xì)胞數(shù)目增多，自噬體主要分布于核周邊的細(xì)胞質(zhì)中。透射電鏡下觀察到的自噬前體可呈新月形或杯狀的雙層膜結(jié)構(gòu)，新月形自噬前體較厚而杯狀自噬

6、前體較薄，自噬體可表現(xiàn)為雙層膜包裹的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，自噬前體或自噬體包繞細(xì)胞質(zhì)樣無形結(jié)構(gòu)或受損的線粒體，自噬溶酶體為包繞單層膜自噬體的單層膜結(jié)構(gòu);與對照組相比，隨著缺氧時(shí)間的延長，自噬結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積之比增大，與缺氧1h組相比，3-MA組細(xì)胞自噬結(jié)構(gòu)與細(xì)胞斷面面積之比明顯減小。缺氧狀態(tài)下，溶酶體數(shù)目增多且體積變大，3-MA組細(xì)胞中溶酶體數(shù)目明顯降低。在自噬與凋亡關(guān)系研究中，檢測到缺氧1h可引起少量細(xì)胞發(fā)生凋亡，阻斷自噬后缺氧引起的細(xì)