1-磷酸鞘氨醇保護無血清狀態(tài)下內(nèi)皮祖細胞的作用及機制的研究.pdf

1、背景： 成人內(nèi)皮細胞屬分化成熟的細胞，增殖能力不強。在組織受損、缺血性疾病和全身炎癥反應綜合征、多器官功能障礙等病程中，有大量血管內(nèi)皮細胞受到損害，這些部位修復(再內(nèi)皮化或血管生成)難以僅僅通過周邊的內(nèi)皮細胞增生、爬行來實現(xiàn)。大量實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在機體內(nèi)具有修復受損血管內(nèi)皮和生成新血管的功能。當前，EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定，體內(nèi)分布、來源、分化、遷徙、歸巢

2、、功能及應用等方面正被廣泛而深入地研究。本研究第一部分，對從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)、擴增出EPCs及細胞鑒定進行探討。 后天血管生成能力與到達修復局部的EPCs的功能和數(shù)量密切相關。在缺血性疾病中，增加缺血部位的EPCs的數(shù)量，可獲得良好的治療效果。由于EPCs的修復作用常需要在缺血的環(huán)境下完成。因此，如何保護EPC s在不利的內(nèi)外環(huán)境中的生存能力，對改善患者預后具有重大意義，也成為目前研究熱點。本研究采用無血清培養(yǎng)法(用去除血清

3、及細胞生長因子的基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞)干預EPCs，觀察在無血清無細胞因子狀態(tài)對EPCs的影響，并用1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，SlP)干預這種狀態(tài)下的EPCs，觀察SlP對EPCs的抗凋亡作用。 Kimura，T等人研究了血漿中的脂蛋白對臍靜脈內(nèi)皮細胞有保護作用的成份，認為SlP通過其受體介導了這種保護作用。同時，外源性SlP也可模擬出這種對內(nèi)皮細胞的保護作用，提示了SlP對細胞的抗凋亡作用及應

4、用潛能。但是這種物質對EPCs的抗凋亡作用及其機制未見報導。該物質是否能夠在血清和生長因子缺乏的不利環(huán)境中保護EPCs，減少或阻止EPCs凋亡，保護局部EPCs，達到促進血管內(nèi)皮修復的作用及機制需要深入研究。 目的： 探討從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)EPCs的方法。觀察無血清狀態(tài)下(用去除血清和細胞因子后的M199基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞)EPCs的凋亡情況及SlP對這種狀態(tài)下EPCs的抗凋亡作用，并深入探討其機制。 研究方

5、法： 1.大鼠骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法，從大鼠骨髓中分離單個核細胞；采用差速貼壁培養(yǎng)法，在大鼠骨髓中分離出的單個核細胞中，培養(yǎng)、擴增EPCs。主要從細胞形態(tài)學、對比應用多種內(nèi)皮細胞的特征標記及功能檢測等方面證實所獲細胞為EPCs，完成細胞鑒定，為下一步研究提供基礎。 2.無血清培養(yǎng)法誘導EPCs的凋亡情況及SlP對EPCs的保護作用：對培養(yǎng)出的EPCs采用無血清培養(yǎng)法進行誘導凋亡，并用不同濃

6、度(0.1、1、10、20μM)SlP進行干預。光鏡觀察不同時間點細胞形態(tài)學改變。Annexin V-FITC凋亡試劑盒檢測細胞凋亡率。 3.SlP對無血清狀態(tài)下EPCs保護作用及機制的探討：采用RT-PCR及Western blot法證實EPCs細胞存在SlP受體。應用受體阻滯劑(PTX)，信號通路阻斷劑(U73122、PP2)等，觀察SlP對EPCs在無血清狀態(tài)下抗凋亡能力的改變，用Western blot法檢測各種預處理后

7、，SlP對EPCs中Akt磷酸化的影響，探討這一過程中抗凋亡作用的信號傳導機制。同時對比檢測培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的含量及EPCs的凋亡率，探討SlP對EPCs的作用機制。 結果： 1.從大鼠骨髓細胞中可分離培養(yǎng)出EPCs。從大鼠骨髓中分離出的細胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，可分離出骨髓來源的單個核細胞(bone marrow-derived mononuclearcells，BMNCs)，；經(jīng)差速貼壁法培養(yǎng)后，可獲得EP

8、Cs。細胞呈梭狀，可形成集落，符合祖細胞的特性；培養(yǎng)20天左右，可形成典型“鋪路石”樣內(nèi)皮細胞。細胞表達CD34、KDR、vWF等分子標記，但僅分離、培養(yǎng)的早期細胞表達CD133，培養(yǎng)9天后，表達CD133標記的細胞儀占總細胞的5％。培養(yǎng)的細胞可吞噬Dil-acLDL，可結合FITC-UEA-1。RT-PCR檢測出培養(yǎng)、擴增后的EPCs中表達CD31、vWF及eNOS等內(nèi)皮細胞特征的mRNA。 2.無血清培養(yǎng)法可誘導EPCs凋亡

9、，且凋亡率隨時間的增加而升高；SlP對去除血清和細胞因子后的M199基礎培養(yǎng)液(以下簡稱基礎培養(yǎng)液)中的EPCs有抗凋亡作用，且抗凋亡作用隨SlP濃度的增加而增強。無血清培養(yǎng)法在體外明顯導致細胞凋亡，使活細胞數(shù)量減少。24小時后，EPCs凋亡率為27.7±1.08％；48小時后凋亡率為為49.3±1.12％。將不同濃度(0.1、1、10、20μM)的SlP加入基礎培養(yǎng)液中進行干預，EPCs凋亡率降低。細胞凋亡率隨SlP濃度的增加而降低，

10、當SlP濃度為20μM時，幾乎可逆轉無血清培養(yǎng)24小時誘導的EPCs的凋亡作用。 3.SlP通過EPCs膜上G蛋白七次跨膜耦聯(lián)的SlP受體發(fā)揮抗凋亡作用，這種作用與NO升高有關。RT-PCR及western blot的結果表明EPCs主要表達SlP受體1、2、3型；而儀表達少量的SlP受體4、5型。與對照組相比，在加入了不同濃度(0.1、1、10、20μM)SlP的基礎培養(yǎng)上清中可測得NO水平增加，同時細胞凋亡率減少，且呈濃度依

11、量性。在上述各組中加入SlP受體阻斷劑(G蛋白受體阻滯劑百日咳毒素，PTX)后，SlP的抗凋亡作用均被完全抑制。各組間EPCs的凋亡率與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義。培養(yǎng)上清中的NO水平與對照組相比差別也無統(tǒng)計學意義。提示SlP誘導NO生成增加介導了SlP對EPCs的抗凋亡作用。 4.SlP對EPCs的抗凋亡作用與活化磷酯酶C(Phospholipase C，PLC)和Src激酶有關。10μM的SlP可顯著減少無血清培養(yǎng)誘導的細胞

12、凋亡，加入PLC抑制劑U73122或Scr激酶抑制劑PP2時，可分別觀察EPCs凋亡率增加，NO產(chǎn)量減少；與對照組相比，加入抑制劑組凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計學意義。同時加入U73122和PP2時，可消除SlP的抗凋亡作用，與對照組和加入PTX組相比，凋亡率和NO的產(chǎn)生量差異均無統(tǒng)計學意義，其作用與PTX完全阻斷SlP受體作用相似。 5.U73122對SlP誘導的Akt磷酸化的抑制作用不明顯，G蛋白和Src激酶抑制劑可顯著抑制A

13、kt磷酸化的表達。用western blot法檢測Akt磷酸化可見，加入10μMSlP干預后的EPCs中Akt磷酸化增加，用U73122預處理EPCs后，Akt磷酸化與僅用SlP干預組相比，差異無統(tǒng)計學意義；而用G蛋白抑制劑PTX和Src激酶抑制劑PP2預處理后，可顯著抑制磷酸化Akt的表達，與儀用SlP干預組相比，差異有統(tǒng)計學意義；G蛋白抑制劑組與Src激酶抑制劑組，磷酸化Akt的表達差異無統(tǒng)計學意義。提示SlP對EPCs抗凋亡作用是

14、通過SlP受體，再由細胞內(nèi)兩條單獨的信號通路介導，生成NO來實現(xiàn)的。 結論： 用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMNCs，采用差速貼壁法可培養(yǎng)、擴增出EPCs。SlP能有效地減少EPCs在血清及細胞因子缺乏的環(huán)境中的凋亡。這種保護作用與激活EPCs膜上SlP受體，誘導NO生成增加有關；主要通路為SlP/SlP受體/PLC和SlP/SlP受體/Src激酶/Akt這兩種途徑產(chǎn)生NO有關SlP對體外缺乏血清和細胞因子環(huán)境中的