1-磷酸鞘氨醇抑制環(huán)磷酰胺致胎兒卵巢卵泡凋亡的研究.pdf

1、目的：隨著科學技術的發(fā)展，放化療大量應用于癌癥患者的治療，使癌癥患者的生存率大大提高。隨著放化療所帶來的卵巢早衰，大大降低了癌癥生存患者的生活質(zhì)量。最近研究證實凋亡是化療導致卵巢早衰的一個重要的機制之一。國內(nèi)外大量動物實驗研究證實1-磷酸鞘氨醇可以抑制放化療導致鋸齒類動物鼠的卵巢卵泡凋亡，但是1-磷酸鞘氨醇是否同樣可以抑制放化療對人的卵巢的破壞作用則研究較少，故本實驗旨在通過建立異種移植模型，將胎兒卵巢組織異種移植到裸鼠體內(nèi)，研究1-磷

2、酸鞘氨醇是否可以通過抑制化療藥物環(huán)磷酰胺導致的胎兒卵巢卵泡的凋亡，發(fā)揮保護卵巢功能的作用。
　　 方法：收集引產(chǎn)胎兒卵巢標本，采用程序化冷凍和快速融解法處理，凍融前后胎兒卵巢組織片經(jīng)光電鏡分析，取足夠新鮮的凍融胎兒卵巢標本進行異種移植至裸鼠背部兩側皮下自制的小囊內(nèi)，將1-磷酸鞘氨醇(S1P)粉劑溶于由5％的聚乙二醇，2.5％的乙醇，0.8％的吐溫-80組成的PET介質(zhì)中，濃度為2.0mM，取部分2.0mM的s1p進一步稀釋至0.

3、5mM濃度;利用微量加樣器將不同濃度的1-磷酸鞘氨醇（A左0.5mM組，A右2.0mM組）、PET（B組）和生理鹽水（C組）和生理鹽水(D組，移植對照組)注入兩側小囊內(nèi)。移植1小時后，A、B、C三組經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺(1mg/ml200mg/kg)，D組未經(jīng)環(huán)磷酰胺處理作為移植對照組。移植2周后回收各組移植物，行石蠟包埋HE染色光鏡分析、戊二醛固定電鏡分析超微結構和免疫組化TUNAL檢測細胞凋亡。
　　 結果：
　　 一

4、.凍融前后胎兒卵巢光鏡下形態(tài)學及電鏡下超微結構的比較
　　 (1)光鏡下觀察，新鮮和凍融組胎兒卵巢組織絕大部分均為原始卵泡，且原始卵泡結構絕大部分均保存較好，為正常原始卵泡結構。與新鮮組相比，凍融組原始卵泡密度稍有降低，無統(tǒng)計學意義(25±14.82 vs24.81±14.36，P＞0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察凍融前后的卵巢的超微結構，新鮮組和凍融組中絕大部分卵泡均保存較完整的結構，較新鮮組，凍融組中卵母細胞中胞

5、漿內(nèi)空泡增多。少部分線粒體體積增大，呈輕度腫脹，嵴偶有消失，僅見個別卵母細胞出現(xiàn)核膜輕度皺縮。
　　 二.凍融組（移植前）胎兒卵巢組織與D組（移植對照組）的比較
　　 (1)HE染色光鏡下觀察見D組（移植對照組）原始卵泡明顯下降，與凍融組（移植前）相比具有統(tǒng)計學意義(15.23±6.28 vs24.81±14.36，p＜0.05)。凍融組（移植前）胎兒卵巢組織絕大部分均為形態(tài)正常的原始卵泡結構。D組（移植對照組）存活的原

6、始卵泡結構正常，部分卵泡出現(xiàn)卵母細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿深染，核膜皺縮。
　　 (2)電鏡下觀察凍融組（移植前）中絕大部分卵泡包膜胞漿核均保存較完整的結構，而D組（移植對照組）中部分卵泡出現(xiàn)結構異常，卵母細胞胞膜尚完整，胞漿內(nèi)偶有空泡形成，線粒體呈輕度腫脹，嵴仍可見，核膜完整，核周隙無擴張，核內(nèi)染色體呈顆粒狀均勻分布。顆粒細胞較完整，與卵母細胞連接較緊密，胞漿內(nèi)有空泡形成，線粒體輕度腫脹，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。
　　

7、 三.異種移植各組胎兒卵巢組織的比較
　　 1.D組（移植對照組）與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）的比較
　　 (1)光鏡下觀察D組（移植對照組），存活的原始卵泡結構保存良好，而C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）卵泡損傷較大，絕大部分原始卵泡結構異常，出現(xiàn)卵母細胞不規(guī)則，胞漿嗜酸性增強，部分細胞核皺縮，核深染，染色質(zhì)聚集。卵母細胞周圍的顆粒細胞不完整，甚至缺如，顆粒細胞排列紊亂，胞漿深染，核固縮，染色質(zhì)聚集?；啄げ煌暾?。卵巢間

8、質(zhì)水腫較明顯，間質(zhì)細胞較少，間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化。與D組（移植對照組）相比，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）原始卵泡密度明顯下降(15.23±6.28 vs8.62±5.00，P＜0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察D組（移植對照組）中存活的卵母細胞胞膜尚完整，胞漿內(nèi)偶有空泡形成，線粒體呈輕度腫脹，嵴仍可見。而C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）大部分卵泡結構均已被破壞，只有部分卵泡尚完整。卵母細胞胞膜不完整，胞漿內(nèi)空泡增多，細胞器結構消失，

9、線粒體腫脹明顯，空泡化，甚至斷裂，核膜皺縮，核染色質(zhì)深染，聚集。顆粒細胞不完整，甚至缺如。顆粒細胞與卵母細胞間微絨毛結構消失，顆粒細胞包膜不完整，胞漿空泡化，甚至核膜消失，核染色質(zhì)深染聚集。
　　 (3)TUNEL檢測，凋亡卵泡數(shù)/所有卵泡數(shù)為凋亡卵泡百分率。與D組（移植對照組）相比，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）中凋亡卵泡百分率明顯增加，且具有統(tǒng)計學意義(15％±3％ vs71％±4％，P＜0.05)。
　　 2.環(huán)磷酰

10、胺處理各組的比較
　　 (1)光鏡下觀察B組(PET+環(huán)磷酰胺組)，C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組），A左組(0.5mM s1p)中，絕大部分原始卵泡結構異常。包膜，胞漿及細胞核結構均出現(xiàn)異常，而A右組(2.0mM s1p)中則大部分原始卵泡結構正常，部分卵泡出現(xiàn)卵母細胞形態(tài)不規(guī)則，胞漿深染。與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）相比，B組(PET+環(huán)磷酰胺組)及A左組(0.5mM s1p)中原始卵泡密度均無明顯差異(8.62±5.00 v

11、s9.31±6.91 vs9.82±5.24， P＞0.05)。而A右組(2.0mM s1p)則明顯較高，且具有統(tǒng)計學意義(8.62±5.00 vs13.25±6.61，P＜0.05)。與A左組(0.5mM s1p)相比，A右組(2.0mM s1p)中原始卵泡密度明顯較高(9.82±5.24 vs13.25±6.61， P＜0.05)。
　　 (2)電鏡下觀察B組（PET+環(huán)磷酰胺組），C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組），A左組(0.

12、5mM s1p)絕大部分卵泡結構均已破壞，而A右組（2.0mM s1p）卵泡結構保存相對較好，部分卵母細胞胞漿內(nèi)水腫明顯，有空泡形成，線粒體腫脹明顯，嵴消失，核膜尚完整，偶有染色質(zhì)深染聚集。顆粒細胞與卵母細胞微絨毛交錯結構尚完整，線粒體腫脹明顯，嵴消失，偶有斷裂，核膜尚完整，偶有核膜皺縮。
　　 (3)TUNEL檢測，與C組（生理鹽水+環(huán)磷酰胺組）相比，B組（PET+環(huán)磷酰胺組）中凋亡原始卵泡百分率無明顯變化(71％±4％ vs

13、68％±3％，P＞0.05)，而A左組(0.5mM s1p)中凋亡原始卵泡百分率則降低，但不具有統(tǒng)計學意義(71％±4％ vs62％±2％，P＞0.05)。在A右組(2.0mM s1p)中則下降明顯(71％±4％ vs18％±2％，P＜0.05)。與A左組(0.5mM s1p)相比，A右組(2.0mM s1p)中凋亡原始卵泡百分率降低明顯，且具有統(tǒng)計學意義(62％±2％ vs18％±2％，p＜0.05)。
　　 結論
　　

14、 1.凍融組中胎兒卵巢中原始卵泡密度比較新鮮組無明顯下降，且電鏡下觀察其超微結構的改變較輕微，結合光電鏡評估常規(guī)慢凍速融方法對人胎兒卵巢卵泡形態(tài)結構保存良好。充分表明凍融胎兒卵巢可代替新鮮胎兒卵巢，有利于實驗的可操作性。
　　 2.移植過程的缺血缺氧導致胎兒卵巢卵泡大量的丟失，僅有部分卵泡能存活。
　　 3.化療藥物環(huán)磷酰胺對卵巢卵泡有明顯的毒性作用，表現(xiàn)為加速胎兒卵巢原始卵泡的凋亡。
　　 4.1-磷酸鞘氨醇