烏賊墨多糖SIP-1干預環(huán)磷酰胺介導小鼠卵巢細胞凋亡與自噬的研究.pdf

1、烏賊墨多糖(Squid ink polysaccharide, SIP)是從廢棄物烏賊墨囊中分離提取得到的具有諸多生物學功能的海洋生物活性物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)SIP對環(huán)磷酰胺(CP)致小鼠腎、肺、肝、睪丸、卵巢損傷具有保護作用。本文旨在探討烏賊墨多糖分離純化后的組分SIP-1的結(jié)構(gòu)及其干預環(huán)磷酰胺介導卵巢細胞凋亡與自噬的機制。
　　本研究經(jīng)酶法提取、乙醇沉淀方法分離提取得到粗多糖，然后經(jīng)過DEAE-52纖維素柱層析和Sephacry

2、l S-300HR凝膠滲透色譜進行分級純化，得到三個糖組成相對單一組分SIP-1、SIP-2、SIP-3，以SIP-1為研究對象，對其純度進行測定。分離純化得到SIP-1經(jīng)紫外掃描顯示260nm及280nm處無吸收峰，說明SIP-1不含有核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。通過高效液相色譜分析，結(jié)果顯示只有一個峰形較對稱且峰寬較窄的峰，說明組分SIP-1較純。
　　對SIP-1進行初級結(jié)構(gòu)分析。紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果分析顯示SIP-1在波

3、數(shù)3385.96 cm-1處有很強O-H伸縮振動和N-H伸縮振動，在波數(shù)2931.23cm-1處有C-H伸縮振動，1637.74cm-1處是氨基N-H變角振動，1077cm-1和1034.21cm-1是多糖羧基中C-O伸縮振動峰。將SIP-1進行完全酸水解，利用高效液相色譜法進行單糖組成分析，結(jié)果表明SIP-1含有氨基半乳糖(GaIN)、阿拉伯糖(Ara)，其摩爾比為1∶1。高碘酸氧化、Smith降解分析結(jié)果顯示SIP-1中可能存在1→

4、2、1→3、1→6類型的糖苷鍵。核磁共振1HNMR和13CNMR分析結(jié)果表明，SIP-1中單糖糖苷鍵和構(gòu)型可能為α-L-Arap存在1→5糖苷鍵，α-D-GalNp存在1→6糖苷鍵。
　　40只健康的昆明種雌性小白鼠，將其隨機分為4組:空白組、模型組、樣品對照組、治療組。15d后，測定小鼠體重、生殖器官重量及指數(shù)、卵巢組織病理學變化及血清激素水平。實驗結(jié)果表明CP對雌性小鼠卵巢具有毒性損傷作用，而SIP-1能緩解CP所致的卵巢生殖

5、損傷作用。與空白組相比，模型組卵巢重量、卵巢指數(shù)、子宮重量及子宮指數(shù)極顯著(P＜0.01)降低，小鼠體重顯著(P＜0.05)下降;光鏡下觀察可見卵巢組織中卵泡總數(shù)、各級卵泡數(shù)顯著減少，閉鎖卵泡增多;卵泡刺激素(FSH)、血清黃體生成素(LH)水平升高，雌激素水平(E2)降低。與模型組相比，SIP-1治療組對CP所致的各項指標變化均有明顯的改善作用(P＜0.05或P＜0.01)。
　　40只健康的昆明種雌性小白鼠，對其分組處理如上。

6、15d后，處死小鼠，取雙側(cè)卵巢，通過透射電鏡分析卵巢超微結(jié)構(gòu)，TUNEL染色檢測卵巢細胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢組織中與細胞凋亡及自噬相關蛋白的表達水平。實驗結(jié)果表明，與空白組相比，模型組在透射電鏡下可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器數(shù)量減少，存在凋亡小體;卵巢細胞的凋亡率極顯著升高(P＜0.01);Bax表達水平、p38磷酸化水平、LC3、Beclin1表達水平顯著提高(P＜0.05或P＜0.01)，Bcl-2、p-Akt表達水平顯著降低

7、(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組相比，SIP-1顯著改善CP所致卵巢的損傷，卵巢細胞的凋亡率顯著降低(P＜0.05)，且SIP-1顯著緩解CP所致Bcl-2、p-AKT表達水平的降低(P＜0.05或P＜0.01)及p38磷酸化水平、LC3、Beclin1表達水平的升高(P＜0.05)。說明SIP-1可能通過調(diào)控與凋亡及自噬相關的蛋白的表達水平來緩解CP所致的卵巢顆粒細胞的凋亡與自噬。
　　SIP-1是一種具有新穎結(jié)構(gòu)的純化