鞘氨醇單胞菌DP58降解吩嗪-1-羧酸(PCA)分子機理的研究.pdf

1、新型生物農(nóng)藥申嗪霉素,其有效成分為吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA),對甜椒疫病和西瓜枯萎病的防治具有廣譜、高效、低毒、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)成本低等顯著特點。但在生物防治過程中發(fā)現(xiàn),PCA在大田中易被降解,影響其防治效果,因此需要研究PCA的生物降解機理,了解它的環(huán)境行為,為提高申嗪霉素的防治效果、合理使用申嗪霉素奠定基礎。本實驗室在此前的研究中已經(jīng)篩選出能夠高效降解PCA的菌株——鞘氨醇單

2、胞菌DP58,并對其降解PCA的特性和降解產(chǎn)物進行了探索。本論文著重研究鞘氨醇單胞菌DP58降解PCA的分子機理。首先,提取鞘氨醇單胞菌DP58全基因組,并使用基因Shear儀將樣品隨機打斷成主帶約為6-8kb的片段、再與pUC118載體連接,構建6-8kb的Shotgun基因文庫。經(jīng)過文庫檢驗,以鄰苯二酚為顯色指示劑從文庫中篩選到陽性轉化子。然后,以PCA為唯一碳、氮源,將陽性轉化子接種于PCA無機鹽溶液中,發(fā)現(xiàn)其對PCA有一定的降解

3、能力,遂將陽性轉化子進行基因測序。根據(jù)測序結果,運用NCBI的BLASTn工具,通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/)進行比對,了解到轉化子插入片段含有五個開放閱讀框(orf1-orf5),其中orf2-orf4為完整的開放閱讀框,分別與鞘氨醇單胞菌RW1(Sphingomonas sp.Strain RW1)EDO2基因簇中三個連續(xù)基因—EDO2、ORFG3和ORFG4相似,相似度達

4、到98％。將篩選出的基因,對比其在文獻報道中的功能,有選擇的克隆于pEASY-E1載體T7啟動子下,并轉化到大腸桿菌BL-21中,驗證其降解功能。由此發(fā)現(xiàn),orf2與orf4基因所編碼的酶在降解中共同起作用,并且都利用了orf3基因所編碼的電子傳遞鏈。此外,在過表達orf2- orf3- orf4基因的PCA無機鹽培養(yǎng)基中,我們分離得到了不穩(wěn)定的紫色物質,并對其進行了液質聯(lián)用質譜(LC-MS)檢測。檢測結果與之前推測的降解中間產(chǎn)物的分子