少動鞘氨醇單胞菌產(chǎn)結(jié)冷膠優(yōu)化及其念珠藻黃素合成相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、革蘭氏陰性菌少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas elodea ATCC31461）能發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠。結(jié)冷膠作為懸浮劑、凝膠劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、乳化劑、賦形劑等可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域，并且可以取代瓊脂等同類食品添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景，市場需求量在逐年增加。然而，結(jié)冷膠產(chǎn)率相對較低，用于通氧攪拌的能耗高、下游提取純化耗費大等問題限制了結(jié)冷膠的推廣應(yīng)用。大多數(shù)的鞘氨醇單胞菌能產(chǎn)生黃色類胡蘿卜素—念珠藻黃素。但目前為止，類胡蘿

2、卜素合成相關(guān)基因還沒有在鞘氨醇單胞菌中被鑒定。少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461在發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的同時也積累黃色類胡蘿卜素，其中大部分為念珠藻黃素。此外，在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液粘度不斷增加，至發(fā)酵結(jié)束時，粘度變得很高，不僅影響發(fā)酵效率，還影響結(jié)冷膠的提取和純化。在傳統(tǒng)的結(jié)冷膠提取方法中，大量的異丙醇或乙醇被用于沉淀多糖、去除色素和其它雜質(zhì)，從而增加了結(jié)冷膠的生產(chǎn)成本。本論文圍繞結(jié)冷膠生產(chǎn)過程的優(yōu)化（包括菌種選育和結(jié)冷膠提取方法的優(yōu)化）以

3、及克隆和鑒定少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461念珠藻黃素合成相關(guān)基因等方面進行了系統(tǒng)研究，為提高結(jié)冷膠生產(chǎn)技術(shù)水平及降低生產(chǎn)成本、解析念珠藻黃素的代謝機理奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、生產(chǎn)菌株的誘變選育對少動鞘氨醇單胞菌Sphingomonas elodea ATCC31461進行EMS、紫外復(fù)合誘變，篩選獲得了一株黃色素生成缺陷的結(jié)冷膠高產(chǎn)突變株，命名為S.elodeaβm007。突變株的結(jié)冷膠產(chǎn)量較親株提高了13

4、％，其所產(chǎn)結(jié)冷膠的甘油酰基和乙?；勘扔H株所產(chǎn)結(jié)冷膠分別高了17％和65％。此外，βm007發(fā)酵液相比野生型菌株在室溫下更穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，βm007相比野生型菌株更適用于高?；Y(jié)冷膠的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并且可以簡化結(jié)冷膠提取方法中的脫色工藝，降低生產(chǎn)成本。
　　 2、克隆和鼓除了八氫番茄紅素脫氫酶基因克隆了少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461的參與類胡蘿卜素合成的八氫番茄紅素脫氫酶基因（crtI）并對基因功能進行了分析。cr

5、tI基因全長為1479bp，編碼492個氨基酸，其氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中存在的其它八氫番茄紅素脫氫酶序列有很高的同源性。敲除crtI后獲得的重組菌株△crtI不產(chǎn)黃色的念珠藻黃素，而是積累無色的八氫番茄紅素，從而確認(rèn)了crtI為八氫番茄紅素脫氫酶基因。進一步的發(fā)酵實驗表明，△crtI重組菌株的結(jié)冷膠產(chǎn)量與野生型菌株相比沒有明顯的區(qū)別，因而可以選用△crtI重組菌株代替ATCC31461進行結(jié)冷膠的發(fā)酵生產(chǎn)，從而簡化結(jié)冷膠提取方法中的脫色工

6、藝。
　　 3、建立了一種高效經(jīng)濟的結(jié)冷膠提取方法基于突變株βm007和△crtI重組菌株在結(jié)冷膠發(fā)酵過程中不產(chǎn)黃色類胡蘿卜素這一特點，設(shè)計了一種新的結(jié)冷膠提取方法并與傳統(tǒng)的提取方法進行了比較。在新的提取方法中，200g/L的CaCl2溶液用于絮凝結(jié)冷膠，30％發(fā)酵液體積的乙醇用于沉淀多糖。新的方法對于△crtI重組菌株發(fā)酵液的提純得率與傳統(tǒng)方法對于野生型菌株發(fā)酵液的提純得率相當(dāng)。與傳統(tǒng)的提取方法使用兩倍發(fā)酵液體積的乙醇用于提取

7、結(jié)冷膠相比，新方法所使用的乙醇量大大減少，從而可以降低結(jié)冷膠的生產(chǎn)成本。
　　 4、念珠藻黃素合成相關(guān)基因的克隆和功能分析克隆了少動鞘氨醇單胞菌ATCC31461的類胡蘿卜素生物合成基因簇和位于基因簇外的β-胡蘿卜素羥化酶基因（crtZ），基因簇中包含4個類胡蘿卜素合成基因crtG、crtY、crtI和crtB。ATCC31461的類胡蘿卜素合成基因與Brevundimonas（也合成念珠藻黃素）的相應(yīng)類胡蘿卜素合成基因具有中等

8、程度的同源性(43％-58％)。對各個類胡蘿卜素合成基因進行了敲除，用色譜和吸收光譜分析各基因缺失菌株的類胡蘿卜素成分，鑒定了各個類胡蘿卜素合成基因的功能。對兩個羥基化β-胡蘿卜素的羥化酶基因—crtZ和crtG（2，2'-β-羥化酶基因）在大腸桿菌中進行了表達，結(jié)果進一步驗證了這兩個基因的功能。crtG分別在積累玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的大腸桿菌中表達時，轉(zhuǎn)化子分別積累念珠藻黃素和2，2'-二羥基-β-胡蘿卜素。基于以上結(jié)果，解析了少動