海洋球石藻病毒參與宿主新型鞘脂類合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及其功能分析.pdf

1、鞘脂類是目前脂類研究的熱點之一，作為食物中的一種天然成分，鞘脂可以歸為食物中的“功能成分”。海洋球石藻（Emiliania huxleyi）是一種海洋真核浮游植物，能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝生物活性物質(zhì)。特別是該藻被特異性病毒(E.huxleyi virus:EhV)感染后能夠合成一系列具有特殊結(jié)構(gòu)的新型鞘脂類活性物質(zhì)，這些鞘脂類有望開發(fā)為新型的天然食品和醫(yī)藥資源。EhV86及其宿主EhCCMP1516全基因組測序注釋結(jié)果顯示，EhV86基

2、因組中存在7個預測編碼鞘脂類合成途徑(SBP)關(guān)鍵催化酶的基因，包括絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)、長壽保障基因類蛋白(LAG1)、脂肪酸去飽和酶(FAD)、酯類磷酸酶(LPP)、甾醇去飽和酶(SD)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)及跨膜脂肪酸伸長蛋白(TFAE)。正是病毒基因組編碼的這些酶在一定程度上掌控著宿主藻細胞鞘脂類的代謝，從而合成并積累宿主新型的鞘脂類物質(zhì)。到目前為止，上述幾種酶中只有SPT功能和生化特性進行了初步研究，其他幾種鞘脂類代謝途

3、徑中酶的功能和確切位置還有待確定。本論文選擇其中兩種關(guān)鍵酶，即SD和FAD為研究對象，從海洋球石藻病毒EhV99B1基因組中克隆獲得該兩種酶基因，對其結(jié)構(gòu)特點進行了系統(tǒng)的生物信息學分析;然后通過基因工程技術(shù)初步分析這兩種酶在酵母細胞鞘脂類代謝途徑中可能的作用;對本實驗室已建立的海洋球石藻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進行了優(yōu)化改進。為進一步構(gòu)建海洋球石藻生物反應器、合成積累新型鞘脂類資源提供科學依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)應用PC

4、R技術(shù)從球石藻病毒EhV99B1基因組中擴增獲得上述兩種酶基因。其中甾醇去飽和酶SD基因全長987bp，編碼328個氨基酸，該蛋白的理論等電點為8.31，分子量為37.83kDa，為疏水性、不穩(wěn)定蛋白，存在6個跨膜結(jié)構(gòu)域，不存在信號肽;其二級結(jié)構(gòu)中螺旋含量最多。脂肪酸去飽和酶FAD基因全長963bp，編碼320個氨基酸，該蛋白的理論等電點為7.26，分子量為37.67kDa，屬于親水性、穩(wěn)定蛋白，存在4個跨膜結(jié)構(gòu)域，不存在信號肽;其二級

5、結(jié)構(gòu)中也是螺旋結(jié)構(gòu)含量最多。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，病毒這兩種基因與宿主球石藻及金色藻屬親緣關(guān)系較近。
　　(2)構(gòu)建了釀酒酵母重組表達載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD，通過醋酸鋰的方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1，對篩選獲得的陽性菌株用D-半乳糖誘導目的基因表達，SDS-PAGE檢測到目的蛋白的表達，其分子量分別為甾醇去飽和酶SD為37.8kDa，脂肪酸去飽和酶FAD為37.6kDa。重組酵母細胞與原始酵母細胞

6、的總脂薄層層析結(jié)果有較大的差別，表明病毒甾醇去飽和酶SD和脂肪酸去飽和酶FAD能夠改變酵母細胞中脂類組成及含量變化，具有一定的催化活性。
　　(3)利用基因工程技術(shù)從pBar、pGFP質(zhì)粒和E.huxleyi BOF92基因組中成功克隆了海洋球石藻內(nèi)源性啟動子FCP-P基因，終止子FCP-T基因、草銨膦抗生素抗性基因Bar、綠色熒光蛋白基因GFP。以psp73作為基礎載體，利用不同酶切位點成功構(gòu)建了pEhux-Ⅰ（psp73-FA

7、P-Bar-FAT1-FBP-FAT2）載體和pEhux-Ⅱ（psp73-FAP-GFP-FAT2）載體;采用PEG介導的方法將兩個載體共轉(zhuǎn)化海洋球石藻BOF92細胞，熒光顯微鏡觀察到部分轉(zhuǎn)化細胞中綠色熒光蛋白基因的表達，通過草銨膦篩選獲得成功轉(zhuǎn)化的藻細胞株;實時熒光定量PCR和Western bloting檢測進一步驗證轉(zhuǎn)化細胞中Bar基因的穩(wěn)定表達。
　　以上研究結(jié)果初步確定了病毒兩種酶基因表達產(chǎn)物具有一定的催化活性，優(yōu)化后的