水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析.pdf

1、本研究通過設(shè)計簡并引物、RT-PCR擴增并結(jié)合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1，原核表達并結(jié)合生化分析方法測定OsLOX1的酶學(xué)特性，對該基因的結(jié)構(gòu)特點、表達特性進行了研究。在此基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將正義和反義OsLOX1基因?qū)胨局仓?，探討OsLOX1在植物體內(nèi)的生理功能及其與抗蟲性的關(guān)系。 研究結(jié)果如下： 1、水稻種子成熟和萌發(fā)過程中脂氧合酶同工酶活力分析利用本實驗室篩選到的LOX-3缺失突變體北

2、陸PL2和正常的水稻品種越光，研究種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)2個水稻品種在種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性變化規(guī)律基本一致，即開花后的10-25天活性持續(xù)升高，以后趨于下降，但在LOX-3缺失的品種(北陸PL2)中變化很?。辉诿劝l(fā)初期LOX活性迅速升高，浸水萌發(fā)后2天達到峰值，然后隨萌發(fā)時間的延長而下降。同工酶分析顯示，在水稻成熟過程中種子LOX-3表達水平及活性都顯著高于其它兩種酶，而在種子萌發(fā)過程中LOX-2表達水

3、平和活性占優(yōu)勢，LOX-1則在兩種情況下都顯示較低的表達水平和活性。研究也進一步證明北陸PL2是LOX-3缺失的水稻品種。 2、水稻成熟過程種胚RNA提取方法的建立建立了一種全新、簡單的提取水稻種胚RNA的CTAB-LiCl提取法，可在不用液氮的室溫下有效地排種胚中大量帶有的多糖和本身脂質(zhì)的干擾，所得RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分析證明具有較高的純度和完整性，并可進一步滿足RT-PCR、Northern印跡以及cD

4、NA文庫構(gòu)建的實驗需要，適用于富含多糖和脂質(zhì)的植物組織RNA的提取。 3、水稻種子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析與表達規(guī)律研究根據(jù)脂氧合酶的保守序列設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR方法，從水稻種胚中克隆了一個新的脂氧合酶基因cDNA片段。進一步用5′-RACE和3′-RACE的方法得到該基因3154bp的全長cDNA(OsLOX1，GenBank登錄號：DQ389164)。進一步克隆了OsLOX1的基因組DNA，OsLO

5、X1基因具有9個外元，8個內(nèi)元。Southern分析顯示該基因在基因組中是單拷貝克隆。分析了該基因啟動子序列，發(fā)現(xiàn)該啟動子含有種子特異表達的順式元件和多個受傷害以及茉莉酸誘導(dǎo)的順式作用元件。組織表達譜分析表明，OsLOX1在未成熟胚、萌發(fā)過程中的種子及幼苗都以較低的水平表達，在正常的根、莖和葉中都不表達，而三葉期的幼苗經(jīng)過傷害誘導(dǎo)3小時后OsLOX1表達量最高，且褐飛虱取食后其轉(zhuǎn)錄物表達量也急劇升高，至6小時達到最高值。這些結(jié)果都表明，

6、OsLOX1的表達受生物和非生物逆境脅迫誘導(dǎo)，參與水稻的防御反應(yīng)；另外，該酶還參與水稻的生長發(fā)育過程。 4、水稻種子脂氧合酶OsLOX1在大腸桿菌中的表達與蛋白特性研究以本實驗室克隆到的水稻種子脂氧合酶OsLOX1全長cDNA為模板，用含有特異酶切位點的P1、P2為引物，通過PCR方法得到該基因的編碼框全長。將其構(gòu)建到大腸桿菌表達載體pET30a(+)上，轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)菌株，獲得含OsLOX1的重組工程菌。經(jīng)過IPT

7、G誘導(dǎo)，水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表達產(chǎn)物在表達菌株中大量積累。誘導(dǎo)16小時后用超聲波破碎儀裂解表達菌株，裂解液用組氨酸標(biāo)簽試劑盒進行純化和復(fù)性。復(fù)性后的蛋白以亞油酸為底物進行酶活測定，結(jié)果顯示，該蛋白具有明顯的脂氧合酶催化活性。利用比色法測得該酶的最適溫度為30℃及最適PH值4.8。本實驗以原核表達的方法得到、并使用組氨酸標(biāo)記試劑盒純化出具有生理活性的水稻種子脂氧合酶OsLOX1，為植物種子脂氧合酶的研究提供了一種可靠的供選擇方法

8、，也為更好地研究水稻種子脂氧合酶OsLOX1的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了良好的材料和方法。研究的結(jié)果也進一步表明本試驗所克隆的基因OsLOX1編碼的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。 5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)正義和反義OsLOX1基因水稻植株及其抗蟲性鑒定利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的兩個雙元載體pLOX1S(35SPro.5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，pLOX1A(35SPro.

9、5’+antisene-OsLOX1cDNA+NosTer3’)，轉(zhuǎn)入粳稻栽培品種北陸PL2中，共得到46個獨立的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過潮霉素篩選葉片和PCR驗證確定得到32個陽性的轉(zhuǎn)基因水稻植株，陽性率為69.6％。潮霉素篩選葉片、種子和Southern blot等檢測都表明，目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。RT-PCR、酶活測定的結(jié)果都表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因水稻中有不同程度的表達。對部分轉(zhuǎn)基因植株進行褐飛虱的鑒定發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)化的對照植株相