水稻磷脂酰絲氨酸合酶OsPSS-SUI1的圖位克隆和功能分析.pdf

1、水稻穗下倒一節(jié)間的伸長(zhǎng)和發(fā)育對(duì)株高起著決定性的作用，深入研究決定水稻穗下節(jié)間伸長(zhǎng)的基因及其分子機(jī)制有望為利用分子育種手段改良水稻株型創(chuàng)造條件。絲氨酸磷脂合酶編碼基因的突變會(huì)造成穗下節(jié)間縮短。但是關(guān)于絲氨酸磷脂合酶和它的產(chǎn)物影響株高的分子機(jī)制仍不清楚。在本文中，對(duì)OsPSS/SUI1進(jìn)行了功能分析，明確OsPSS/SUI1或磷脂酰絲氨酸在植物細(xì)胞生物學(xué)上的功能和相應(yīng)的分子機(jī)制。本文主要研究結(jié)果如下：
　　1.來(lái)源于Kitaake的組

2、織培養(yǎng)誘變突變體sui1-4表現(xiàn)出株型矮化，育性降低，分蘗數(shù)輕微增高。突變體穗長(zhǎng)和各節(jié)間長(zhǎng)度均縮短，尤其是第一節(jié)間縮短最為嚴(yán)重。石蠟切片結(jié)果顯示：突變體sui1-4在倒一節(jié)間居間分生組織細(xì)胞細(xì)胞分化停滯，細(xì)胞松散，無(wú)規(guī)則，在伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞不伸長(zhǎng)。透射電鏡觀察表明，而突變體sui1-4薄壁細(xì)胞沒(méi)有伸長(zhǎng)，細(xì)胞之間不能粘合在一起。
　　2.免疫膠體金和高壓冷凍電鏡結(jié)果顯示：在突變體sui1-4中，大量的JIM7金顆粒以復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞

3、質(zhì)中。在灌漿時(shí)期的突變體倒一節(jié)間，盡管兩細(xì)胞之間的中膠層有 JIM7金顆粒的存在，但是大部分薄壁細(xì)胞的外側(cè)沒(méi)有JIM7的分布。大量的JIM7顆粒存在―細(xì)胞流‖或者堆積在已經(jīng)分泌到細(xì)胞間隙的細(xì)胞流頭部。
　　3. Western blot分析表明，在突變體sui1-4中，OsCESA4蛋白雜交信號(hào)更多地存在于內(nèi)膜分相系統(tǒng)（DEX）。secGFP在原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的分布情況顯示，突變體sui1-4secGFP大部分停滯在原生質(zhì)中

4、，僅有少量的secGFP被分泌到培養(yǎng)基中。以上暗示著sui1-4是分泌缺陷型突變體。
　　4.液相色譜法測(cè)定第一節(jié)間細(xì)胞壁單糖及纖維素的含量。結(jié)果顯示，纖維素的含量在突變體中下降了大約12％。相應(yīng)地，組成纖維素的重要的單糖-葡萄糖（Glc）從65.1 mg/g降到35.7 mg/g。構(gòu)成半纖維素和果膠質(zhì)的單糖成分木糖（Xyl）和半乳糖醛酸（GalA）的含量是增加的，分別從281.2 mg/g和7.45 mg/g增加到389.1 m

5、g/g和21.64 mg/g。突變體sui1-4的分泌缺陷影響了細(xì)胞壁的含量。
　　5.圖位克隆的方法克隆了磷脂酰絲氨酸合酶phosphatidylserine synthase（Os01g02890，被命名為OsPSS/SUI1）。其編碼區(qū)發(fā)生了堿基A→T的替換，從而導(dǎo)致該ORF氨基酸序列從天冬氨酸（Asp）225到纈氨酸（Val）的替換。轉(zhuǎn)基因和干擾驗(yàn)證均可以確定OsPSS/SUI1的突變的確是引起包穗表型的目的基因。

6、　　6.熒光定量結(jié)果顯示，OsPSS/SUI1基因在水稻的幼穗、幼根、莖、葉片不同組織中均有表達(dá)。其中幼穗的表達(dá)量最高。GUS活性檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：在幼苗時(shí)期，GUS表達(dá)主要在根部伸長(zhǎng)區(qū)和根毛；抽穗前4周，GUS活性檢測(cè)分布在頂端分生組織和莖稈的基部；抽穗前一周和抽穗時(shí)期 GUS活性檢測(cè)分布在莖稈的分化和伸長(zhǎng)區(qū)域，尤其在極速生長(zhǎng)的第一節(jié)間表達(dá)量最大，當(dāng)細(xì)胞伸長(zhǎng)結(jié)束發(fā)展成成熟組織時(shí)，GUS表達(dá)量下降直至完全消失。
　　7. OsPSS/

7、SUI1屬于跨膜蛋白。在擬南芥原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)化 OsPSS/SUI1-GFP與 Golgi apparatus、TGN/EE、PVC、PM和液泡膜等標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化12小時(shí)后，OsPSS/SUI1-GFP蛋白僅與ER Marker共定位。轉(zhuǎn)化36小時(shí)后，OsPSS/SUI1-GFP蛋白的定位信號(hào)不僅與 ER Marker部分共定位，還與cis-Golgi和TGN marker部分共定位，與PM marker完全共定位，而不與PVC&nb

8、sp;和液泡膜Marker共定位。能識(shí)別PS的LactC2蛋白的定位與OsPSS/SUI1的定位類(lèi)似。
　　8.磷脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明MBP-OsExo70E1和MBP-OsExo70A1能夠結(jié)合PS。野生型和突變體穗部和倒二節(jié)間PS的含量磷脂含量均降低。OsExo70E1干擾植株的每個(gè)節(jié)間的長(zhǎng)度相似比例地降低。透射電子顯微鏡下比較野生型和OsExo70E1干擾植株橫向和縱向的細(xì)胞排列，表先出不規(guī)則且與sui1-4類(lèi)似的較大的細(xì)胞間隙。