水稻產(chǎn)量抽穗期基因DTH7的圖位克隆與功能分析.pdf

1、水稻產(chǎn)量是人們最關(guān)心的農(nóng)藝性狀，適宜的生育期是決定水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)，因此，選育高產(chǎn)而早熟的品種一直為水稻育種工作者所重視。本研究首先分析了來(lái)源于亞洲17個(gè)國(guó)家和地區(qū)的91個(gè)代表性品種的抽穗期與感光性以及產(chǎn)量與抽穗期之間的關(guān)系，利用以Kitaake為背景導(dǎo)入PA64S片段的38個(gè)近等基因系中的一個(gè)對(duì)這種關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了具體分析。同時(shí)，采用圖位克隆的方法對(duì)這個(gè)同時(shí)調(diào)控水稻產(chǎn)量、株高和抽穗期的基因QTL-qDTH7進(jìn)行了精細(xì)定位，克隆了

2、其候選基因OsPRR37。另外，對(duì)水稻中已經(jīng)克隆的同時(shí)調(diào)控水稻產(chǎn)量、株高和抽穗期的基因Ghd7和DTH8與DTH7進(jìn)行了功能性不同組合與抽穗期之間的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)它們的不同組合與水稻的抽穗期之間存在顯著的關(guān)聯(lián)性。具體研究結(jié)果如下:
　　1、利用從亞洲的17個(gè)國(guó)家和地區(qū)收集的91個(gè)具有代表性的地方栽培稻品種，在三亞、南京、北京和哈爾濱4個(gè)地點(diǎn)種植。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，隨著日照長(zhǎng)度的延長(zhǎng)，水稻的抽穗期逐漸延長(zhǎng)，水稻產(chǎn)量與其抽穗期之間存在

3、比較顯著的關(guān)聯(lián)性。
　　2、對(duì)以粳稻品種Kitaake為背景導(dǎo)入秈稻品種PA64S片段的一個(gè)近等基因系QTL-qDTH7在四種日照時(shí)間不同的條件觀(guān)察其表型，發(fā)現(xiàn)隨著日照時(shí)間的延長(zhǎng)，Kitaake和NIL-DTH7的抽穗期都延遲，但是相對(duì)于Kitaake，NIL-DTH7延遲更明顯;增產(chǎn)也更加顯著。
　　3、利用NIL-DTH7×Kitaake的次級(jí)F2群體以及后續(xù)的F2∶3群體，將qDTH7定位于第7染色體長(zhǎng)臂末端和標(biāo)記IN

4、D-36之間約114 kb的物理范圍之內(nèi)。通過(guò)對(duì)Kitaake和NIL-DTH7中OsPRR37的基因組進(jìn)行測(cè)序比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)親本中，該基因總共有10個(gè)氨基酸發(fā)生了變異，其中在Kitaake的CCT結(jié)構(gòu)域中，有一個(gè)保守的氨基酸由L變?yōu)榱薖。推測(cè)OsPRR37就是DTH7的候選基因，而Kitaake的CCT結(jié)構(gòu)域中的氨基酸變異是可能是造成NIL-DTH7和Kitaake表型變異的最主要原因。
　　4、為了進(jìn)一步確認(rèn)OsPRR3

5、7的功能，構(gòu)建了OsPRR37的基因組全長(zhǎng)互補(bǔ)、DTH7的自身啟動(dòng)子+CDS轉(zhuǎn)化水稻品種Kitaake和35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥野生型種子Col-0。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化基因組全長(zhǎng)片段的轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量、株高和抽穗期都達(dá)到了近等基因系的水平;而轉(zhuǎn)化DTH7的自身啟動(dòng)子+CDS的轉(zhuǎn)基因植株并沒(méi)有獲得近等基因系的表型。同時(shí)，過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株無(wú)論在長(zhǎng)日還是短日條件下，都比野生型表現(xiàn)出早開(kāi)花的表型。
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量

6、PCR分析顯示，DTH7在水稻各組織中都有表達(dá)，且在葉片等幼嫩組織中表達(dá)量最高，同時(shí)其表達(dá)受到光的誘導(dǎo);亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示，DTH7定位于細(xì)胞核中，在酵母中具有轉(zhuǎn)錄抑制活性;DTH7的表達(dá)具有節(jié)律性，在長(zhǎng)日和短日條件下光照后8小時(shí)后都有一個(gè)表達(dá)峰。DTH7的表達(dá)水平在Kitaake中比在NIL-DTH7中高，前者幾乎都達(dá)到了后者的兩倍。分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)日條件下DTH7通過(guò)抑制Ehd1的表達(dá)來(lái)抑制Hd3a的表達(dá)，最終導(dǎo)致水稻抽穗的延遲;同時(shí)

7、無(wú)論在長(zhǎng)日還是短日條件下，DTH7的表達(dá)都受到PhyB的誘導(dǎo)。以上結(jié)果表明DTH7在水稻光周期開(kāi)花途徑中起著非常重要的作用。
　　6、DTH7在水稻的莖桿及穗的發(fā)育過(guò)程中也起著非常重要的作用。DTH7通過(guò)增加初級(jí)枝梗數(shù)和次級(jí)枝梗數(shù)來(lái)增加穗粒數(shù)從而提高水稻的產(chǎn)量。DTH7功能的變?nèi)趸蛉笔?huì)導(dǎo)致水稻植株莖桿變小以及各節(jié)間都明顯縮短，細(xì)胞學(xué)觀(guān)察表明節(jié)間組織細(xì)胞的縮短是植株矮化的直接原因。DTH7的功能變?nèi)趸蛉笔?dǎo)致每穗粒數(shù)急劇減少，產(chǎn)量

8、下降，但千粒重沒(méi)有發(fā)生明顯變化。
　　7、將Kitaake和NIL-D TH7分別在不同的日長(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)在抽穗期通路中處于DTH7的下游基因以及DTH7進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著日照時(shí)間的延長(zhǎng)，DTH7下游促進(jìn)水稻開(kāi)花的基因受DTH7的抑制而表達(dá)逐漸降低，這與其在自然條件下的表型變異是一致的。
　　8、OsPRR37是水稻中PRRs家族基因的5個(gè)成員之一，擬南芥中的PRRs家族基因的表達(dá)存在如下的順序表達(dá)模

9、式:PRR9→PRR7→PRR5→ PRR3→ PRR1。通過(guò)對(duì)Kitaake和NIL-DTH7進(jìn)行連續(xù)光照和連續(xù)黑暗處理，發(fā)現(xiàn)PRRs家族基因在水稻中也存在相似的順序表達(dá)模式:OsPRR73→OsPRR37→OsPRR95(OsPRR59)→OsPRR1。
　　9、對(duì)水稻中已經(jīng)克隆的同時(shí)調(diào)控水稻產(chǎn)量、株高和抽穗期的基因Ghd7、DTH8與DTH7一起進(jìn)行了單倍型不同組合與抽穗期之間的關(guān)聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的功能性與抽穗期表型存在