水稻感光基因dth2的精細(xì)定位及感溫基因LTG1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、水稻品種的抽穗期主要由其感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性決定。感光性、感溫性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性，使得抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化;這使得抽穗期的遺傳表現(xiàn)異常復(fù)雜，呈現(xiàn)典型的質(zhì)量/數(shù)量性狀(QTL)遺傳特征。因此，發(fā)掘和鑒定新的水稻抽穗期基因/QTLs，開展抽穗期基因精細(xì)定位、克隆等方面的研究，深入探討水稻抽穗期基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控對于闡明植物開花的分子機(jī)理與合適生育期水稻品種的選育具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 利用Asomin

2、ori遺傳背景攜帶IR24插入片段的染色體片段置換系，并進(jìn)一步構(gòu)建近等基因系，我們成功地鑒定了一個(gè)感光基因dth2和一個(gè)控制低溫生長的感溫基因LTG1。本文中，我們還對LTG1的功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它的C端發(fā)生單個(gè)氨基酸替換后，使得水稻變得對低溫極其敏感，影響了水稻的生長發(fā)育進(jìn)程，進(jìn)而影響水稻產(chǎn)量。LTG1還可能是一個(gè)馴化相關(guān)基因。主要結(jié)果如下:
　　 1.水稻抽穗期QTL定位及感光基因dth2的分離、鑒定與精細(xì)定位。
　

3、　 利用源于秈稻品種IR24和粳稻品種Asominori的重組自交系（RILs）群體，檢測到3個(gè)抽穗期QTLs，dth2，dth6和dth8，分別位于第2，6和8染色體，LOD值分別為3.82，5.23和5.46，貢獻(xiàn)率分別為14.64％，20.03％和27.35％。這三個(gè)QTL分別和前人報(bào)道的Hd7, Hd1以及Hd5等位，鑒于Hd1和Hd5均已被克隆而Hd7僅僅被初步定位于相距20cM以上的標(biāo)記C1221與C1408之間，我們選擇

4、dth2進(jìn)行更深入、細(xì)致的研究。為了精細(xì)定位QTL dth2，利用以Asominori為背景親本，IR24為供體親本的染色體片段置換系(CSSLs)群體，鑒定出晚抽穗的攜帶dth2插入片段的家系CSSL23。從CSSL23與Asominori雜交構(gòu)建的次級F2群體中，再次檢測到dth2(LOD值24.70，貢獻(xiàn)率26.22％)。此外，還檢測到另一個(gè)QTL dth3(LOD值13.12，貢獻(xiàn)率14.91％)，該QTL和前人報(bào)道的Hd8等位

5、，并被限定在3.2cM以內(nèi)。利用南京自然長日照環(huán)境、人工遮光短日環(huán)境以及海南冬季自然短日等多個(gè)環(huán)境處理發(fā)現(xiàn)，dth2和dth3都具有在長日照條件下延遲抽穗的功能并且這兩個(gè)QTL是獨(dú)立遺傳的，這兩個(gè)感光性質(zhì)相同的QTL之間的聯(lián)合作用顯著延遲了CSSL23的抽穗期。進(jìn)一步利用分子標(biāo)記輔助選擇的方法(MAS)，構(gòu)建了僅攜帶dth2的近等基因系-NIL（dth2）并利用NIL（dth2）×Asominori的次級F2、F2∶3以及F3∶4群體，

6、最終將dth2限定在標(biāo)記RM13910與ind8之間約56.8kb的區(qū)間范圍內(nèi)，共有13個(gè)候選基因。序列分析發(fā)現(xiàn)第8個(gè)編碼Zn-finger蛋白且與Hd1同源的基因在兩親本之間存在序列差異，導(dǎo)致氨基酸序列改變，暗示著該基因可能是目的基因。這些結(jié)果為對dth2的進(jìn)一步圖位克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.LTG1的圖位克隆與功能分析
　　 在本研究中，我們在攜帶IR24插入片段的Asominori染色體片段置換系（共66個(gè)家系）

7、中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)對溫度極其敏感的家系CSSL13。利用構(gòu)建的次級分離群體，將該基因定位于標(biāo)記RM3762和RM263之間，并命名為LTG1。隨后利用初定位的結(jié)果，通過回交以及分子標(biāo)記輔助選擇的方法，構(gòu)建了微目的片段的近等基因系NIL(ltg1)，將該基因進(jìn)一步定位于標(biāo)記dcaps1和ind14之間約25.4-kb的區(qū)間范圍內(nèi)，和標(biāo)記L264、dcaps2共分離。該區(qū)間內(nèi)有4個(gè)假定的ORFs，從序列比較和轉(zhuǎn)基因的結(jié)果判斷:ORF3是目的基因，

8、它編碼一個(gè)Casein kinaseⅠ亞家族的蛋白。盡管LTG1無論在高溫還是低溫條件下，在兩個(gè)親本之間的酶活都無顯著差異，但在低溫條件下，來自IR24位點(diǎn)的ltg1表達(dá)量明顯減少。亞細(xì)胞定位表明，LTG1主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并且不隨溫度的改變而改變。RT-PCR、Real-time PCR以及GUS染色結(jié)果表明LTG1是一個(gè)組成性表達(dá)的基因。為了探明LTG1的作用途徑，利用基因芯片以及Real-time PCR分析了LTG1的可