水稻中調(diào)控抽穗期的關(guān)鍵基因OsCOL13的克隆與生化分析.pdf

1、水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物之一，為全世界數(shù)十億的人提供能量。水稻是一個(gè)短日照植物，在開(kāi)花方面表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光周期敏感性。開(kāi)花在植物整個(gè)生命周期中起著重要的作用，它決定了植物對(duì)不同外部環(huán)境的適應(yīng)性，同時(shí)也受到內(nèi)部信號(hào)和外界環(huán)境刺激的影響。在所有的開(kāi)花調(diào)控因子中，光周期是最重要且被廣泛研究的影響因素。目前許多參與到光周期途徑的基因已經(jīng)在長(zhǎng)日照植物擬南芥以及短日照植物水稻中被鑒定出來(lái)，同時(shí)建立起了OsGI/GI-Hd1/

2、CO-Hd3a/FT信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中CONSTANS(CO)作為擬南芥的開(kāi)花整合子在長(zhǎng)短日照條件下都促進(jìn)開(kāi)花。但水稻中CO的同源基因Heading date1（Hd1）卻起到雙重相反的功能，它在長(zhǎng)日照條件下抑制開(kāi)花，在短日照條件下誘導(dǎo)開(kāi)花。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)水稻CONSTANS-like（COL）基因OsCOL13，它參與到水稻光周期開(kāi)花調(diào)控過(guò)程中。為了研究OsCOL13在開(kāi)花調(diào)控中所起的作用，我們通過(guò)遺傳學(xué)、分子

3、生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)等技術(shù)手段對(duì)OsCOL13的功能進(jìn)行了深入解析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)OsCOL13抑制水稻開(kāi)花。無(wú)論在短日照條件(14h黑暗/10h光照)還是在長(zhǎng)日照條件（10h黑暗/14 h光照）下，OsCOL13過(guò)表達(dá)植株都比野生型Kitaake延遲開(kāi)花3周左右。同時(shí)，將OsCOL13基因過(guò)表達(dá)到另外兩種光周期敏感的粳稻品種中花11和W030中，轉(zhuǎn)基因植株開(kāi)花時(shí)間也顯著延遲。利用CRISPR-Cas9技術(shù)我們

4、獲得了三個(gè)獨(dú)立的OsCOL13突變體，但突變體與野生型相比開(kāi)花時(shí)間沒(méi)有明顯變化，暗示OsCOL13可能與其它的OsCOL基因存在功能冗余。
　　(2)OsCOL13主要在葉片、葉鞘、莖桿以及穗子中表達(dá)，在根中相對(duì)比較低，同時(shí)在不同發(fā)育階段葉片中的表達(dá)維持穩(wěn)定。此外，GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在所有組織中都能檢測(cè)到GUS活性，暗示OsCOL13組成型表達(dá)。原位雜交顯示OsCOL13在葉片的葉肉細(xì)胞中大量表達(dá)。
　　(3)Os

5、COL13是一個(gè)節(jié)律表達(dá)的基因，其表達(dá)受到光照和節(jié)律鐘的調(diào)控。OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平在長(zhǎng)短日照下都是從傍晚開(kāi)始積累，在黎明時(shí)達(dá)到最大，之后迅速降低直至傍晚。OsCOL13的表達(dá)在整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段沒(méi)有太大的變化，并且長(zhǎng)日照下的表達(dá)量要高于短日照條件下的表達(dá)量，同時(shí)在全光照條件下OsCOL13能維持節(jié)律性振幅也沒(méi)有改變，而在全黑暗條件下雖然還能維持節(jié)律表達(dá)，但其振幅急劇減少。
　　(4)通過(guò)在水稻原生質(zhì)體中觀察OsCOL13-GFP

6、融合蛋白的熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)OsCOL13嚴(yán)格的定位于細(xì)胞核中，與核參照蛋白D53-mCherry完全重疊。OsCOL13-BD融合蛋白與BD對(duì)照相比在酵母菌株AH109中展現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且激活域位于B-box和CCT兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域之間，與已報(bào)道的CO和DTH2相類似。這些結(jié)果表明，OsCOL13可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。
　　(5)OsCOL13與自身互作，以同源二聚體的形式行使功能。當(dāng)用Flag標(biāo)簽抗

7、體檢測(cè)過(guò)表達(dá)植株中OsCOL13-Flag融合蛋白時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)一條約為70 kDa的條帶，它是OsCOL13-Flag單體蛋白的兩倍。隨著提取緩沖液中DTT濃度的增加，70 kDa條帶逐漸減弱，而一條35 kDa的條帶逐漸增強(qiáng)。暗示OsCOL13可能以二聚體的形式存在。此外，體外pull-down和BiFC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)OsCOL13可以形成二聚體。
　　(6)OsCOL13在水稻開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中位于OsphyB的下游Ehd1的上游

8、。OsCOL13作為一個(gè)組成型的負(fù)調(diào)節(jié)子，通過(guò)下調(diào)Ehd1的表達(dá)進(jìn)而抑制Hd3a和RFT1的表達(dá)，從而延遲開(kāi)花，并且獨(dú)立于其它的Ehd1調(diào)節(jié)子。通過(guò)在水稻開(kāi)花相關(guān)的近等基因系以及突變體中檢測(cè)OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)OsCOL13的表達(dá)量在osphyb突變體中顯著降低，暗示OsphyB可能促進(jìn)OsCOL13的表達(dá)。
　　(7)OsCOL13直接調(diào)控OsLBD38的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)OsLBD38基因可能直接受OsCOL13的