野油菜黃單胞菌8004與胞外多糖合成相關(guān)基因的鑒定.pdf

1、野油菜黃單胞菌野菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.campestris,以下簡(jiǎn)稱Xcc)是一種能在全球范圍內(nèi)引起十字花科植物黑腐病的病原性細(xì)菌.胞外多糖是Xcc的重要致病因子之一,也是一種重要的工業(yè)多糖.該實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了Xcc8004的Tn5gusA5插入突變庫(kù),并對(duì)16462株突變體的EPS產(chǎn)量進(jìn)行了平板檢測(cè),獲得了75株胞外多糖產(chǎn)量下降突變株.本工作用2％葡萄糖的NYGA平板上檢測(cè),對(duì)這75個(gè)突變體進(jìn)行

2、了重新篩選,得到了51株胞外多糖缺陷的突變體,它們分布在45個(gè)ORF中.其中11個(gè)ORF前人已證實(shí)與胞外多糖合成有關(guān);34個(gè)ORF未報(bào)道與胞外多糖的產(chǎn)生相關(guān),這34個(gè)ORF中13個(gè)編碼的為假設(shè)保守蛋白.本工作選擇這13個(gè)編碼的為假設(shè)保守蛋白的基因的一個(gè),編號(hào)為XC0877,進(jìn)行進(jìn)一步研究,以確定該ORF是否與EPS合成有相關(guān).根據(jù)Xcc8004的Tn5gusA5插入突變庫(kù)的資料,XC0877 ORF中有四個(gè)獨(dú)立的Tn5gusA5插入突變

3、體,其中有兩個(gè)突變體為胞外多糖缺陷型,另兩個(gè)突變體為胞外多糖產(chǎn)生正常.我們初步認(rèn)為這種表型不一致的原因有可能是ORF界定有誤.為了確證XC0877 ORF與胞外多糖產(chǎn)生的關(guān)系,我們采用同源單交換的方法構(gòu)建了該ORF的非極性定點(diǎn)整合突變體.并對(duì)所得突變體進(jìn)行了胞外多糖產(chǎn)量檢測(cè),出乎意料的是在這些突變體中大約有一半表現(xiàn)為缺陷型而另一半則表現(xiàn)為胞外多糖產(chǎn)生正常.用PCR方法擴(kuò)增野生型XC0877 ORF(包括啟動(dòng)子),并克隆到pLAFR3上,