1-磷酸鞘氨醇及中性神經(jīng)酰胺酶保護(hù)炎癥因子引起的胰島β細(xì)胞凋亡.pdf

1、1-磷酸銷氨醇及中性神經(jīng)酰胺酶保護(hù)炎癥因子引起的胰島β細(xì)胞凋亡 目的： (1)觀察外源性1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是否減少炎癥因子引起的胰島β細(xì)胞凋亡。 (2)探討S1P保護(hù)胰島β細(xì)胞的可能機(jī)制。 (3)觀察胰島β細(xì)胞是否存在中性神經(jīng)酰胺酶(neutral ceramidase，N-CDase)活性及表達(dá)。 (4)觀察炎癥因子刺激是否引起胰島β細(xì)胞N-

2、CDase的活性及表達(dá)變化。 (5)觀察抑制N-CDase活性是否影響炎癥因子引起的胰島p細(xì)胞凋亡。 方法： (1)貼壁法培養(yǎng)大鼠胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用炎癥因子白介素-1β(IL-1β，5 ng/mL)、腫瘤壞死因子(TNF-a，10 ng/mL)和干擾素一γ(IFN-γ，50 ng/mL)刺激INS-1細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。 (2)1μMS1P預(yù)處理INS-1細(xì)胞1 h，隨

3、后，應(yīng)用炎癥因子及S1P與INS-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。 (3)western-blot方法檢測凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3的表達(dá)。 (4)應(yīng)用有機(jī)萃取和高效液相色譜(HPLC)方法定量測定正常培養(yǎng)以及炎癥因子刺激下INS-1細(xì)胞的N-CDase的活性。 (5)采用半定量RT-PCR和定量real-time PCR方法測定正常培養(yǎng)以及炎癥因子刺激下INS-1細(xì)胞的N-CD

4、ase基因表達(dá)，western-blot方法檢測N-CDase蛋白表達(dá)。 (6)應(yīng)用N-CDase抑制劑D-MAPP(終濃度為10μM)抑制INS-1細(xì)胞N-CDase活性，HPLC方法測定抑制后酶活性的降低。 (7)應(yīng)用D-MAPP與炎癥因子共培養(yǎng)INs-1細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： (1)INS-1細(xì)胞貼壁生長狀況良好，正常培養(yǎng)條件下凋亡不明顯；而聯(lián)合應(yīng)用炎癥因子IL-1β、TNF

5、-αIFN-γ刺激24 h后INS-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。 (2)應(yīng)用1μMS1P預(yù)處INS-1細(xì)胞并與細(xì)胞共培養(yǎng)，能顯著減少炎癥因子引起的細(xì)胞凋亡。 (3)應(yīng)用1μMS1P預(yù)處理并與INs-1細(xì)胞共培養(yǎng)，能顯著抑制炎癥因子刺激下的細(xì)胞cleaved-caspase-3的表達(dá)。 (4)正常培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞存在一定的N-CDause活性，炎癥因子刺激能明顯增加INS-1細(xì)胞的N-CDase活性：最早在刺激8 h后

6、即能觀察到N-CDase活性明顯增加，在刺激16 h后達(dá)到高峰，并且，這種增加在刺激24 h后仍能被檢測到。 (5)炎癥因子刺激能明顯增加INs-1細(xì)胞的N-cDase蛋白表達(dá)，并與其活性增加的時間依賴性較一致。 (6)炎癥因子刺激能明顯增加INs-1細(xì)胞的N-CDase基因表達(dá)，在刺激4h后出現(xiàn)N-CDase基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，刺激12h后達(dá)到高峰。 (7)應(yīng)用10μMD-MAPP預(yù)處理及與INs-1細(xì)胞共培養(yǎng)，

7、能明顯降低正常培養(yǎng)和炎癥因子刺激的INS-1細(xì)胞的N-CDase活性。 (8)應(yīng)用10μMD-MAPP預(yù)處理及與INS-1細(xì)胞共培養(yǎng)，能明顯增加炎癥因子刺激引起的INS-1細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： (1)聯(lián)合應(yīng)用炎癥因子刺激24 h能引起INS-1細(xì)胞凋亡，而外源性S1P能減輕炎癥因子引起的細(xì)胞凋亡。 (2)S1P可能通過抑制凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3表達(dá)，從而減輕炎癥因子引起的INS-1細(xì)