1-磷酸鞘氨醇受體在LPS和TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性中的作用.pdf

1、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是一種存在于血漿中的多效信號脂質(zhì)分子。它既可在細(xì)胞內(nèi)作為第二信使傳遞信號,同時,它亦可作為第一信使與細(xì)胞膜上相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體相互作用參與包括細(xì)胞遷移、存活、增殖、血管生成、免疫以及過敏反應(yīng)等生物學(xué)作用。本研究選取ECV 304和HMVEC細(xì)胞,采用RT-PCR和Western blot方法,在明確ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)特性的基礎(chǔ)上,探討LP

2、S或TNF-α刺激對這兩種細(xì)胞S1P受體表達(dá)的影響；并通過雙層小室檢測內(nèi)皮細(xì)胞單層熒光標(biāo)記物的漏出率,用通透系數(shù)Pa的大小反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性,觀察其受體表達(dá)和活性的變化對LPS或TNF-α所致的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性中的作用。
　　 一、S1P受體在ECV 304和HMVEC中的特點(diǎn)
　　 已有不少文獻(xiàn)報(bào)道,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的S1P受體主要是S1P1R、S1P2R和S1P3R。本實(shí)驗(yàn)證明了ECV 304及HMVEC細(xì)胞中均有

3、S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA的表達(dá)。但在蛋白水平上,ECV 304細(xì)胞中僅可見S1P2R的蛋白條帶,而在HMVEC中,可見S1P1R、S1P2R和S1P3R的蛋白條帶。結(jié)果顯示:在ECV304細(xì)胞中較多表達(dá)S1P2R,而不表達(dá)S1P1R和S1P3R。在HMVEC中,S1P1R的表達(dá)較多,S1P3R的表達(dá)次之,而S1P2R表達(dá)較少。結(jié)果提示,雖然在mRNA水平上ECV 304和HMVEC的S1P受體表達(dá)沒有差別,但蛋白表達(dá)顯

4、示明顯的特點(diǎn)。本結(jié)果進(jìn)一步證明,不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞S1P受體的表達(dá)各有差異,體現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性；研究還首次查明了ECV 304和HMVEC中S1P受體表達(dá)的特點(diǎn)。
　　 二、LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)的改變及其對通透性的影響
　　 1.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的改變
　　 (1)LPS刺激后ECV 304細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的

5、改變
　　 LPS刺激后,ECV 304細(xì)胞S1P1R和S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),亦未見明顯的蛋白表達(dá)。
　　 (2)LPS刺激后HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的改變
　　 LPS刺激后,HMVEC的S1P1R和S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),蛋白表達(dá)亦未見明顯變化。
　　 2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改

6、變
　　 (1)LPS刺激后ECV 304細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改變
　　 結(jié)果表明,LPS刺激可以分別以劑量和時間依賴的關(guān)系使ECV 304細(xì)胞S1P2R mRNA的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.05)；蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在ECV 304細(xì)胞中,LPS以劑量和時間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.01)。
　　 (2)LPS刺激后HMVEC細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改變
　　

7、結(jié)果表明,LPS刺激可以分別以劑量和時間依賴的關(guān)系使HMVEC細(xì)胞S1P2R mRNA的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.05)；蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在HMVEC細(xì)胞中,LPS以劑量和時間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.05)。
　　 3.抑制S1P2R的活性對LPS介導(dǎo)的ECV 304和HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響
　　 (1)抑制S1P2R的活性對LPS介導(dǎo)的ECV 304內(nèi)皮細(xì)胞高

8、通透性的影響
　　 在ECV 304細(xì)胞中,0.2 nmol/ml JTE-013使Pa值從單純LPS刺激的192％下降到134％(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。
　　 (2)抑制S1P2R的活性對LPS介導(dǎo)的HMVEC中內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響
　　 在HMVEC中,JTE-0130.2 nmol/ml使Pa值從單純LPS刺激的206％下降到156％(P

9、=0.010)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。
　　 三、TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)的改變及其對通透性的影響
　　 1.TNF-α僅刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變
　　 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變
　　 結(jié)果表明,TNF-α刺激可以分別以劑量和時間依賴的關(guān)系使ECV

10、304細(xì)胞S1P1R mRNA的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.01)。結(jié)果提示,TNF-α刺激ECV 304細(xì)胞可使其S1P1R的mRNA表達(dá)水平顯著增加。
　　 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變
　　 在HMVEC細(xì)胞中,100 ng/ml的TNF-α刺激24 h后使S1P1R的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.01),且刺激12 h和24 h后的變化也有顯著差異。之間有顯著差別(P<0.

11、05)。結(jié)果提示,TNF-α刺激HMVEC細(xì)胞可時間依賴地導(dǎo)致S1P1R的mRNA表達(dá)水平增加。
　　 2.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變
　　 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變
　　 TNF-α刺激可以分別以劑量和時間依賴的關(guān)系使ECV 304細(xì)胞S1P2RmRNA的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.01)；蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在ECV304細(xì)

12、胞中,TNF-α以劑量和時間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.05)。
　　 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變＼
　　 結(jié)果表明,TNF-α刺激可以劑量依賴的關(guān)系使HMVEC細(xì)胞S1P2R mRNA的表達(dá)較正常對照組顯著增加(P<0.05)；但在時間效應(yīng)中,TNF-α刺激12 h后S1P2R mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)現(xiàn)象(P<0.01),在24 h后S1P2R mR

13、NA表達(dá)則顯著增加(P<0.01)。蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在HMVEC細(xì)胞中,TNF-α以劑量依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增高(P<0.05)；而在時間效應(yīng)中,S1P2R蛋白表達(dá)在刺激24 h后出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。
　　 3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化
　　 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化
　　 TNF-α刺激后

14、,ECV 304的S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化
　　 TNF-α刺激后,HMVEC的S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4.抑制S1P2R的活性對TNF-α介導(dǎo)的ECV 304和HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響
　　 (1)抑制S1P2R的活性對TNF-α介導(dǎo)ECV 304內(nèi)皮細(xì)胞

15、高血管通透性的作用
　　 在ECV 304細(xì)胞中,0.2 nmol/ml JTE-013使Pa值從單純TNF-α刺激的208％下降到156％(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。
　　 (2)抑制S1P2R的活性對TNF-α介導(dǎo)HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高血管通透性的作用
　　 在HMVEC細(xì)胞中,0.2 nmol/ml JTE-013使Pa值從單純TNF-α刺激

16、的209％下降到153％(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。
　　 結(jié)論:
　　 1.靜息ECV 304細(xì)胞表達(dá)S1P1R、S1P2R和S1P3R mRNA,S1P2R蛋白。而靜息HMVEC表達(dá)S1P1R、S1P2R和S1P3R mRNA和蛋白。
　　 2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R的mRNA及蛋白表達(dá)均無明顯變化,

17、S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高。結(jié)果提示S1P2R的表達(dá)增加可能參與介導(dǎo)LPS刺激對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
　　 3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC中的S1P2R和蛋白表達(dá)顯著提高；TNF-α刺激也引起ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R mRNA的表達(dá)增高；而S1P3R的mRNA表達(dá)無明顯改變。結(jié)果提示S1P2R的表達(dá)增加可能參與介導(dǎo)TNF-α刺激對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
　　 4.抑制S1P2R的活性