p115RhoGEF-RhoA信號(hào)通路參與調(diào)控LPS及TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的機(jī)制研究.pdf

1、感染性腦損傷是兒科常見(jiàn)的危急重癥，雖然隨著高效抗生素的廣泛應(yīng)用，近年死亡率有所下降，但其致殘率仍然很高，存活的患兒中約有30％-50％留有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。感染性腦損傷時(shí)血腦屏障(blood-brainbarrier，BBB)通透性增高所致的顱高壓是其患者致死或致殘的主要原因之一。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)及BMECs間的緊密連接(tightjunction，

2、TJ)是維持BBB結(jié)構(gòu)和功能完整的主要成分及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。已有的研究發(fā)現(xiàn)多種因素參與了感染性腦損傷時(shí)BBB通透性增高的發(fā)生發(fā)展，涉及細(xì)菌毒素如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)與BMECs的相互作用。目前對(duì)TJ的研究主要以肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞為對(duì)象，感染性腦損傷時(shí)LPS致BMECs通透性增高、BMECs-TJ改變及其調(diào)控機(jī)制的研究

3、較少。
　　 小分子G蛋白R(shí)ho(Rashomologous，Rho)屬于Ras超家族，包括Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac和Cdc42三個(gè)亞家族，在細(xì)胞骨架的相關(guān)活動(dòng)如細(xì)胞遷移、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞變形、收縮粘附等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。其中，RhoA、Rac1和Cdc42是研究最為深入的成員。RhoA通過(guò)其上游的鳥(niǎo)苷酸交換因子(guaninenucleotideexchangefactors，GEFs)與G蛋白耦聯(lián)受體

4、（GPCRs）密切聯(lián)系;RhoA下游的Rho激酶激活后可取代肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinase，MLCK)直接磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosinlightchain，MLC)，提高肌球蛋白活性，使肌動(dòng)-肌球蛋白交聯(lián)增加，導(dǎo)致細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙擴(kuò)大。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Rho激酶特異性抑制劑Y-27632可以部分抑制LPS誘導(dǎo)的體外BBB通透性增高，提示LPS可能通過(guò)RhoA信號(hào)途徑影響B(tài)BB通透性。因此

5、，研究LPS及TNF-α對(duì)BMECs的影響并探討其具體的調(diào)控機(jī)制，有助于了解感染性腦損傷時(shí)BBB通透性增高的病理過(guò)程，為其臨床防治提供新的思路。本研究分為三部分:
　　 第一部分LPS對(duì)原代大鼠BMECs通透性的影響及機(jī)制
　　 目的:探討LPS對(duì)大鼠BMECs通透性的影響及其可能的機(jī)制。
　　 方法:分離和培養(yǎng)原代大鼠BMECs，隨機(jī)分為對(duì)照組和LPS干預(yù)組。利用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗(transendothelia

6、lelectricalresistance，TEER)檢測(cè)BMECs通透性，pull-down法測(cè)定RhoA活性，Westernblot檢測(cè)p115RhoGEF和TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組(159.0±8.6Ω·cm2)比較，LPS作用3h時(shí)大鼠BMECs的TEER值明顯下降(108.3±4.21Ω·cm2)，作用12h時(shí)LPS干預(yù)組TEER達(dá)最低水平(85.4±2

7、.52Ω·cm2)。Pull-down法證實(shí)LPS作用5min后RhoA活性增高，15min達(dá)到高峰;Westernblot證實(shí)LPS作用1h后p115RhoGEF蛋白表達(dá)上調(diào)，3h達(dá)到高峰，12h降至正常水平;LPS作用3h后TJ蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)均有不同程度下降。
　　 結(jié)論:LPS導(dǎo)致BMECs通透性增高，其機(jī)制與TJ蛋白表達(dá)水平下降有關(guān)。p115RhoGEF/RhoA信號(hào)通路的活化可

8、能與此過(guò)程有關(guān)。
　　 第二部分p115RhoGEF/RhoA信號(hào)通路參與LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控
　　 目的:探討p115RhoGEF/RhoA信號(hào)途徑參與LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:(1)體外培養(yǎng)小鼠BMECs株（bEnd.3細(xì)胞），Westernblot檢測(cè)LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)p115RhoGEF的表達(dá)水平;
　　 (2)合成p115RhoGEF小干擾RNA(s

9、iRNA)并轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞，Westernblot鑒定siRNA對(duì)p115RhoGEF蛋白表達(dá)的抑制作用;
　　 (3)bEnd.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染p115RhoGEF-siRNA或給予RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理，pull-down法檢測(cè)LPS刺激后RhoA活性變化，TEER檢測(cè)BMECs通透性改變，直接免疫熒光觀(guān)察纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)變化，Westernblot檢測(cè)TJ蛋白ZO-1、occludin、claudi

10、n-5蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:(1)LPS作用bEnd.3細(xì)胞1h后，p115RhoGEF蛋白表達(dá)水平上調(diào)，3h達(dá)到高峰;
　　 (2)轉(zhuǎn)染p115RhoGEF-siRNA的bEnd.3細(xì)胞p115RhoGEF蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少;
　　 (3)C3轉(zhuǎn)移酶組RhoA活性被完全抑制，LPS刺激后TEER值較對(duì)照組增高，ZO-1、occludin、claudin蛋白表達(dá)下降不明顯;與C3轉(zhuǎn)移酶組相比，抑制p1

11、15RhoGEF表達(dá)可部分抑制LPS誘導(dǎo)的RhoA活化、TEER下降及ZO-1表達(dá)減少;轉(zhuǎn)染p115RhoGEF-siRNA和C3轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理可以減少LPS導(dǎo)致的F-actin重組。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建p115RhoGEF-siRNA抑制bEnd.3的p115RhoGEF表達(dá)，證實(shí)p115RhoGEF/RhoA信號(hào)通路參與了LPS致BMECs通透性增高的調(diào)控。
　　 第三部分Rho信號(hào)通路與TNF-α致BMECs通透性

12、增高相關(guān)
　　 目的:證實(shí)Rho信號(hào)通路與TNF-α致BMECs通透性增高相關(guān)。
　　 方法:(1)以培養(yǎng)至融合的小鼠BMECs株（bEnd.3細(xì)胞）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，Westernblot檢測(cè)RhoA總蛋白表達(dá)，pull-down法檢測(cè)TNF-α刺激后RhoA活性;
　　 (2)p115RhoGEF-siRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞，Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p115RhoGEF蛋白表達(dá)的抑制情況;
　

13、　 (3)p115RhoGEF-siRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞，pull-down法檢測(cè)TNF-α刺激后RhoA活性變化。
　　 (4)bEnd.3細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TNF-α干預(yù)組和Y-27632預(yù)處理組，觀(guān)察bEnd.3細(xì)胞TEER的變化。
　　 結(jié)果:RhoA活性在TNF-α刺激30min后明顯增高并達(dá)到高峰，RhoA總蛋白表達(dá)在TNF-α刺激12h和24h顯著上調(diào);TNF-α刺激30min，p115RhoGE