急性肺損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙連接蛋白40與血管通透性的關(guān)系研究.pdf

1、為探索急性肺損傷（ALI）時(shí)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙連接蛋白40（Cx40）的表達(dá)，連接通道（GJC）功能的狀態(tài)改變，細(xì)胞損傷以及細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化與內(nèi)皮細(xì)胞通透性之間的關(guān)系，本研究進(jìn)行了下列三部分實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)一.急性肺損傷兔肺組織通透性改變與Cx40的表達(dá)研究
　　目的：觀察ALI時(shí)家兔肺組織通透性與微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx40表達(dá)的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用胸部戰(zhàn)傷方法建立家兔急性肺損傷模型，將傷后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單救治存活下來(lái)的家兔隨

2、機(jī)分為6組，每組6例，每例動(dòng)物在傷前、傷后6、12、24、48，72小時(shí)取動(dòng)脈血檢測(cè)IL-8和TNF-α含量；于各時(shí)段分別處死動(dòng)物，取肺組織做HE病理和免疫組織化學(xué)染色（Cx40）；伊文思藍(lán)漏出率法測(cè)肺微血管通透性；干濕比法測(cè)肺的含水量。
　　結(jié)果：HE染色見(jiàn)傷肺肺泡腔內(nèi)大量滲出液體和紅細(xì)胞的滲出聚集，肺泡隔增厚、斷裂、融合，大量白細(xì)胞滲出、聚集，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。對(duì)側(cè)肺組織肺泡腔內(nèi)液體滲出、紅細(xì)胞聚集，肺泡隔內(nèi)白血病浸潤(rùn)，毛細(xì)血

3、管擴(kuò)張充血。傷后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)血清中TNF-α和IL-8含量均高于致傷前(p<0.05)。傷后24小時(shí)以后各時(shí)間點(diǎn)，肺組織含水量均有明顯升高(p<0.05)，持續(xù)至72小時(shí)。肺組織伊文思藍(lán)漏出率隨著時(shí)間的發(fā)展升高(p<0.05)。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜Cx40染色較傷前減弱，OD值顯著減小(p<0.05)，并與伊文思藍(lán)漏出率呈負(fù)相關(guān)（γ=-0.934,P<0.05,γ2=0.8723）。
　　實(shí)驗(yàn)二.急性肺損傷兔肺

4、微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變與Cx40的關(guān)系研究
　　目的：觀察離體培養(yǎng)的兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變與Cx40表達(dá)、GJC功能之間的關(guān)系。
　　方法：組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞分為三組，對(duì)照組、創(chuàng)傷血清處理組和阻滯劑組。在阻滯劑組，細(xì)胞間隙連接通道阻滯劑1-庚醇（0.5mM）加入到培養(yǎng)液中。1小時(shí)后，阻滯劑組和創(chuàng)傷血清組的20％胎牛血清的培養(yǎng)液均被更換為含有20％創(chuàng)傷血清的培養(yǎng)液。對(duì)照組則只更換培養(yǎng)液。三組

5、細(xì)胞繼續(xù)孵育6小時(shí)后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)觀察。分別做劃痕實(shí)驗(yàn)、Cx40蛋白免疫印跡和單層細(xì)胞通透性檢測(cè)。
　　結(jié)果：培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞融合成單層，呈典型的鋪路石樣鑲嵌狀排列。Cx40蛋白印跡見(jiàn)創(chuàng)傷血清組與阻滯劑組蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組有明顯降低，且兩組之間亦不同，阻滯劑組蛋白水平較創(chuàng)傷血清組低（對(duì)照組為1±0.07，創(chuàng)傷血清組為0.55±0.15，阻滯劑組為0.43±0.13，n=4，p<0.05）。三組細(xì)胞劃痕邊緣的細(xì)胞均被染料LY染色，LY在

6、對(duì)照組細(xì)胞擴(kuò)散得最遠(yuǎn)，顯色的周邊細(xì)胞的數(shù)量最多，創(chuàng)傷血清組次之，阻滯劑組顯色的細(xì)胞數(shù)量最少。相鄰細(xì)胞與邊緣細(xì)胞的比值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（23±5，11±3ver7±2，n=4，p<0.05）。
　　三組細(xì)胞伊文思藍(lán)清除率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且三組細(xì)胞間亦有不同，阻滯劑組清除率高于創(chuàng)傷血清組和對(duì)照組。組間差別和時(shí)間點(diǎn)差別均有顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)三：急性肺損傷兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx40對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度的影響研究

7、>　　目的：觀察急性肺損傷時(shí)離體培養(yǎng)的兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx40與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度變化之間的關(guān)系。
　　方法：兔肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和分組同實(shí)驗(yàn)二。三組細(xì)胞繼續(xù)孵育6小時(shí)后，提取培養(yǎng)液測(cè)定LDH含量，加入fluo-3AM負(fù)載檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca++鈣濃度。
　　結(jié)果：通過(guò)共聚焦顯微鏡的觀察，三組細(xì)胞熒光強(qiáng)度不相同，阻滯劑組熒光最強(qiáng)，對(duì)照組最弱。創(chuàng)傷血清組和阻滯劑組細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度均顯著高于對(duì)照組，(nmol/L

8、,494.8±41.94,569.8±6.70versus158.8±13.09,p<0.05)。創(chuàng)傷血清組和阻滯劑組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量均顯著高于對(duì)照組(IU/L,165.88±16.17,186.4±24.91versus51.31±13.27,p<0.05)，且血清組與阻滯劑組之間的差別亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，三組細(xì)胞內(nèi)Ca++含量與培養(yǎng)液中LDH的濃度還存在正相關(guān)關(guān)系(γ=0.997,p<0.05,γ2=0.994)。
　

9、　結(jié)論：
　　1.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，肺組織通透性升高與肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞Cx40表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在離體培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，富含炎癥介質(zhì)的創(chuàng)傷血清能夠抑制Cx40的水平和GJC的功能，與此同時(shí)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，二者存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，Cx40水平和GJC功能的下降能夠明顯增加肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。
　　2.創(chuàng)傷因素所致的Cx40水平和GJC功能的抑制，與內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca++濃度和和細(xì)胞損傷是負(fù)相關(guān)關(guān)系。