Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞高通透性中的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　肺微血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血氣屏障的重要結(jié)構(gòu)之一，其通透性的增加是急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）的重要病理生理基礎(chǔ)。肺微血管內(nèi)皮細胞在炎癥因子的作用下一方面內(nèi)皮細胞本身發(fā)生水腫，使得血氣屏障的厚度增加導(dǎo)致彌散效率下降，另一方面大量炎癥細胞發(fā)生肺內(nèi)“扣押”，聚集的炎癥細胞發(fā)生活化，釋放大量炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)可直接損傷微血管內(nèi)皮細胞，同時炎癥介

2、質(zhì)可激活更多炎癥細胞，從而導(dǎo)致級聯(lián)放大的炎癥效應(yīng)產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的大量炎癥因子可使肺微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞骨架的重組以及細胞間連接蛋白發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細胞間隙增大，細胞屏障功能受損，細胞單層通透性增加。
　　小窩蛋白（caveolin）作為小窩（caveolae）的結(jié)構(gòu)性蛋白，其腳手架（scaffolding domain）能與多種信號分子結(jié)合，從而賦予小窩信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐的作用。埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白（e

3、zrin/radixin/moesin，ERM）組成了ERM蛋白家族，三個蛋白的N端氨基酸序列（FERM）具有高度同源性，并且FERM將細胞骨架 F-actin與膜相蛋白相連，從而調(diào)節(jié)多種信號通路，如細胞遷移、生長和粘附等。ERM的活化主要通過其C端的結(jié)構(gòu)域與自身或者另外一個單體的FERM結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，形成單聚體或者同源、異源二聚體。這種分子間的相互作用導(dǎo)致的頭尾相連，掩蓋了 ERM蛋白中膜蛋白和骨架蛋白的結(jié)合位點，從而使 ERM處于失

4、活狀態(tài)。
　　本研究擬通過觀察抑制caveolin-1的表達對TNF-α致RPMVECs單層高通透性的調(diào)節(jié)以及對RPMVEC骨架重組和ERM磷酸化的影響，探討caveolin-1的作用；再通過抑制moesin的表達初步研究moesin在TNF-α致傷RPMVECs中的作用。
　　方法：
　　1.體外分離、培養(yǎng)原代RPMVECs并鑒定。
　　2.利用transwell分別構(gòu)建體外caveolin-1低表達和正常表達

5、的RPMVECs單層細胞模型。按照相應(yīng)的實驗分組給予不同的刺激后檢測跨內(nèi)皮細胞電阻（transendothelial electrical resistance，TER）變化和對牛血清白蛋白的通透性變化。
　　3.利用激光共聚焦顯微鏡觀察RPMVECs在給予不同藥物刺激后骨架蛋白F-actin和磷酸化ERM的變化。
　　4.通過western blot檢測不同實驗分組中ERM磷酸化水平改變。
　　5.構(gòu)建靶向moesi

6、n的載體質(zhì)粒，并包裝相應(yīng)慢病毒感染RPMVECs下調(diào)moesin的表達。
　　6.分別檢測moesin低表達和正常表達的RPMVECs構(gòu)建的細胞單層受到TNF-α刺激后TER的改變。
　　結(jié)果：
　　1.體外成功分離培養(yǎng)RPMVECs，經(jīng)形態(tài)學(xué)、FITC-植物血凝素結(jié)合試驗和CD34染色證實。
　　2.原代RPMVECs感染慢病毒后48小時在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白（GFP）表達72小時后GFP表達強度進一步

7、增大。感染caveolin-1-shRNA lentivirus的RPMVECs總caveolin-1表達于感染后48小時開始降低，72小時達到最低值，約為初始的21±6％。陰性對照組caveolin-1表達無顯著變化。
　　3. Caveolin-1低表達的細胞單層模型正常狀態(tài)下 TER較陰性對照組 TER略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有給予刺激的組別其 TER于15min開始降低，3小時降低至最大值。抑制caveolin-1

8、表達能夠減輕TNF-α和PKC激動劑PMA誘導(dǎo)的TER降低。低表達caveolin-1的細胞單層預(yù)先給予PKC抑制劑BIM作用2小時再給予TNF-α刺激相對于給予同樣處理的caveolin-1表達正常細胞單層，其電阻降低進一步減輕?？偟膩碚fPKC抑制劑BIM可減輕TNF-α導(dǎo)致的跨細胞單層電阻降低，抑制 caveolin-1表達后可在此基礎(chǔ)上進一步減輕但仍然低于正常組。TNF-α和PMA作用RPMVECs4h后，RPMVECs單層對FI

9、TC-BSA通透性增加至陰性對照組的8倍。PKC抑制劑BIM顯著降低TNF-α致RPMVECs單層對FITC-BSA的通透性，但仍然高于正常對照組。
　　4.未給予任何刺激的RPMVECs中，F(xiàn)-actin主要分布于細胞外周近細胞膜處；未見F-actin聚集為粗大的張力纖維。同時細胞內(nèi)可檢測到少量磷酸化ERM表達，均勻彌散分布于整個細胞內(nèi)，并且 RPMVECs感染慢病毒和下調(diào) caveolin-1的表達對RPMVECs中F-act

10、in以及ERM的磷酸化水平影響不明顯，與正常對照組（normal組）無明顯差異。
　　5.給予低表達 caveolin-1的 RPMVECs TNF-α刺激2h后，F(xiàn)-actin較正常組（control-shRNA組）形成增加，但與陰性對照刺激組（control-shRNA+TNF-α組）相比，F(xiàn)-actin形成顯著減少，跨細胞應(yīng)力纖維形成不明顯；ERM磷酸化水平增加程度不及正常組（control-shRNA組）但較陰性對照刺激組

11、（control-shRNA+TNF-α組）明顯減少。
　　6. PKC激動劑PMA作用于caveolin-1正常表達的RPMVECs后可見F-actin聚集，應(yīng)力纖維形成，ERM磷酸化顯著增加（與normal組相比），而PMA作用于抑制caveolin-1表達的RPMVECs后應(yīng)力纖維形成明顯減少，ERM磷酸化亦顯著降低。在 caveolin-1表達正常的 RPMVECs中抑制 PKC的活化仍可見 TNF-α所至的F-actin

12、的聚集和應(yīng)力纖維的形成，但 ERM磷酸化顯著降低（與control-shRNA+TNF-α組相比）。
　　7.成功構(gòu)建三個重組pLL3.7-moesin載體質(zhì)粒，并且包裝為相應(yīng)慢病毒，經(jīng)濃縮后滴度依次為109TU/ml、109TU/ml、3×109 TU/ml。三個靶位點對moesin表達抑制效率分別為61.5±11.2%、53.6±8.5%、76.1±3.8%。
　　8. RPMVECs在正常情況下即有少量磷酸化ERM表達

13、，TNF-α作用2小時后ERM磷酸化顯著增加，PKC抑制劑 BIM可抑制 TNF-α介導(dǎo)的 ERM磷酸化。抑制caveolin-1的表達可顯著降低 TNF-α介導(dǎo)的 ERM磷酸化，同時 BIM在caveolin-1低表達的RPMVECs中抑制TNF-α介導(dǎo)的ERM磷酸化作用不顯著。
　　9.抑制moesin表達可減輕TNF-α介導(dǎo)的RPMVECs單層通透性增高。
　　結(jié)論：
　　1. Caveolin-1可通過調(diào)節(jié) P