TNF-α對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Src抑制的蛋白激酶C底物表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對(duì)培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)表達(dá)的影響及甲基強(qiáng)的松龍(甲強(qiáng)龍)對(duì)TNF-α所致大鼠PMVEC單層通透性損傷和SSeCKS表達(dá)的干預(yù)作用。 方法：根據(jù)TNF-α刺激時(shí)間與濃度的差異，將培養(yǎng)的大鼠PMVEC隨機(jī)分為TNF-α?xí)r間刺激組與濃度刺激組，前組以5000 U/ml的TNF-α分別與PMVEC作用0.5 h，1.5 h，3 h，6

2、 h，12 h；后組分別以200 U/ml，1000 U/ml，5000 U/ml的TNF-α與PMVEC作用3 h。藥物干預(yù)：分別以5000 U/ml的TNF-α和0.2 mg/ml的甲強(qiáng)龍+5000U/ml的TNF-α與PMVEC作用1.5h。以上均設(shè)立正常對(duì)照組，運(yùn)用RT-PCR法及Western-blot法檢測(cè)SSeCKS mRNA及蛋白的表達(dá)變化。用針頭式濾器檢測(cè)TNF-α(5000 U/ml)組及甲強(qiáng)龍(0.2 mg/ml)

3、+TNF-α(5000 U/ml)組作用1.5h后大鼠PMVEC單層通透系數(shù)(Kf)，以正常PMVEC單層通透性作對(duì)照。 結(jié)果：1.體外成功分離培養(yǎng)出大鼠PMVEC，并經(jīng)形態(tài)學(xué)及FITC-PHA結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)。2.通過對(duì)正常對(duì)照組大鼠PMVEC的RT-PCR法及Western-blot法檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)SSeCKS特異性條帶。3.正常情況下大鼠PMVEC低表達(dá)SSeCKS。5000 U/ml的TNF-α作用PMVEC后，SSeCKS

4、mRNA及蛋白的表達(dá)自0.5h開始增高，3h達(dá)到高峰，隨后漸行性下降但維持較高表達(dá)水平至12h，以上各時(shí)間點(diǎn)mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組。表明TNF-α可以時(shí)間依賴的方式上調(diào)SSeCKS的mRNA及蛋白的表達(dá)。4.200 U/ml，1000 U/ml，5000 U/ml的TNF-α作用PMVEC后，SSeCKS mRNA及蛋白的表達(dá)依次遞增，均明顯高于正常對(duì)照組。表明TNF-α可以濃度依賴的方式上調(diào)SSeCKS的mRNA及蛋

5、白的表達(dá)。5.甲強(qiáng)龍+TNF-α組SSeCKS的蛋白表達(dá)明顯低于。TNF-α組，而甲強(qiáng)龍+TNF-α組PMVEC單層通透系數(shù)(Kf)也明顯低于TNF-α組。表明甲強(qiáng)龍抑制TNF-α所致大鼠PMVEC單層通透性增加的同時(shí)，降低SSeCKS蛋白高表達(dá)水平。 結(jié)論：1.體外成功培養(yǎng)鑒定大鼠PMVEC。2.從mRNA及蛋白水平證實(shí)大鼠PMVEC表達(dá)SSeCKS。3.TNF-α以時(shí)間及濃度依賴的方式上調(diào)大鼠PMVEC中SSeCKS的mRN