Caveolin-1在TNF-α誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是臨床常見急危重癥,發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,臨床缺乏有效治療手段,病死率高。盡管已明確炎性介質(zhì)作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)是導(dǎo)致ARDS的重要原因,但研究表明,單純通過阻斷或封閉炎性介質(zhì)難以取得理想效果。近些年來,研究的熱點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向那些能夠?qū)⒍喾N信號(hào)通路聯(lián)系在一起,并對它們進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)身上,如小窩蛋白-1,試

2、圖由此開辟一條ARDS發(fā)病機(jī)制研究的新方向。
　　小窩(Caveolae)又稱膜內(nèi)陷囊泡,是細(xì)胞膜表面特異性的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu),廣泛分布于機(jī)體內(nèi),參與細(xì)胞分化、增殖、炎癥、腫瘤、衰老等多種病理生理過程。Caveolae在調(diào)控微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性方面的研究并不多見并且各項(xiàng)研究的結(jié)果尚存在很大的爭論:部分研究報(bào)道小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)的敲除增加血管內(nèi)皮的通透性,另一部分研究認(rèn)為敲除Caveolin-1會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)

3、皮通透性的降低。因此,小窩在肺微血管內(nèi)皮通透性中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　炎癥介質(zhì)如:腫瘤壞死因子-α(TNF-α),內(nèi)毒素(LPS)和凝血酶等,引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,主要是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙的形成。而其機(jī)制包括:誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞收縮以及破壞細(xì)胞間的連接。而細(xì)胞骨架蛋白的重構(gòu)和細(xì)胞間的連接受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。小G蛋白家族由于能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附和細(xì)胞骨架的動(dòng)力,很早被認(rèn)為在調(diào)控內(nèi)皮屏障功能中居于重要的地

4、位,尤其是Rac1可以通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin的重構(gòu),加強(qiáng)細(xì)胞間的連接,增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。
　　皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(cortactin)是廣泛存在的酪氨酸激酶的靶點(diǎn),是Rac1信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白之一,牽涉到皮層肌動(dòng)蛋白的組裝和重構(gòu)。目前確定,在內(nèi)皮功能加強(qiáng)的情況下,cortactin在細(xì)胞邊界處聚集,導(dǎo)致皮層肌動(dòng)蛋白分布增加,功能增強(qiáng),而這一過程依賴于Rac1的激活。在Cortactin基因敲除的內(nèi)皮細(xì)胞

5、,那些能夠穩(wěn)定內(nèi)皮屏障功能的藥物如cAMP、PGE2和PGI2等并不能夠降低炎癥因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性增高。
　　綜上所述,Rac1-cortactin信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性調(diào)控中具有重要作用,而caveolin-1對血管內(nèi)皮通透性的影響是否與該通路有關(guān),目前尚未見報(bào)道。
　　目的:
　　構(gòu)建caveolin-1基因RNA干擾慢病毒,觀察抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-ɑ誘導(dǎo)的RPMVECs通透性變化

6、的影響,探討其作用機(jī)制,豐富ARDS的基礎(chǔ)理論,并為臨床防治ARDS提供新的思路。
　　方法:
　　1.pLL3.7-caveolin-1shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建:確定編碼caveolin-1-shRNA的DNA序列,將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pLL3.7上并進(jìn)行慢病毒包裝、分離以及滴度的測定。
　　2.RPMVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用體外肺組織塊貼壁法行原代RPMVECs分離、培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,RPMV

7、ECs形態(tài)學(xué)特征,并采用植物凝集素結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。
　　3.慢病毒(含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs及鑒定:慢病毒(含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs,感染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,采用稀釋計(jì)數(shù)法測定病毒滴度,用Western-blotting法鑒定轉(zhuǎn)染RPMVECs中目的蛋白表達(dá)情況,確定caveolin-1表達(dá)抑制的效率。
　　4.抑制C

8、aveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機(jī)制
　　RPMVECs分為正常細(xì)胞、轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞。按照如下實(shí)驗(yàn)方案分組:正常細(xì)胞未刺激組,正常細(xì)胞TNF-α刺激組,正常細(xì)胞O-Me-cAMP刺激組,正常細(xì)胞O-Me-cAMP+TNF-α共刺激組,陰性沉默對照組(controlshRNA),陰性沉默(controlshRNA)細(xì)胞TNF-α刺激組,Caveolin-1基因沉默組(

9、Caveolin-1shRNA),Caveolin-1基因沉默細(xì)胞+TNF-α刺激組,Caveolin-1基因沉默細(xì)胞+NSC23766+TNF-α刺激組。
　　1)抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響:采用跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(transendothelialelectricalresistance,TER)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記白蛋白法觀察細(xì)胞單層通透性變化。
　　2)抑制Caveolin

10、-1基因表達(dá)對TNF-α引起肺微血管內(nèi)皮骨架蛋白重構(gòu)的影響:免疫熒光染色激光共聚焦觀察F-actin和cortactin分布變化;western-blot半定量分析cortactin在胞漿和胞膜量的變化。
　　3)抑制Caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起肺微血管內(nèi)皮單層通透性變化、內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)產(chǎn)生影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制:Pull-down及western-blot半定量分析Rac1活性。
　　結(jié)果:
　　1

11、.經(jīng)酶切和測序證實(shí),成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLL3.7-caveolin-1shRNA,病毒包裝后經(jīng)濃縮得到的病毒懸液滴度為2×108TU/ml。
　　2.獲得原代培養(yǎng)的RPMVECs,經(jīng)光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和植物凝集素結(jié)合試驗(yàn)加以鑒定。
　　3.慢病毒感染RPMVECs后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。Westernblotting法可檢測到相應(yīng)目的蛋白表達(dá),24h后即出現(xiàn)caveolin-1的表達(dá)抑制,48h抑制

12、caveolin-1的表達(dá)至陰性沉默對照組caveolin-1表達(dá)水平的60±10％;72h抑制達(dá)最小值約為陰性沉默對照組的10±2%。而陰性沉默對照組caveolin-1表達(dá)水平在0、24、48、72h變化不大,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機(jī)制
　　1)抑制caveolin-1基因表達(dá)對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響:100ng/

13、mlTNF-α刺激RPMVECs單層時(shí),TER呈時(shí)間依賴性下降;在刺激2小時(shí),TER下降最顯著,降到基礎(chǔ)值的63±5%;FITC-BSA的通透率升高最顯著,達(dá)到基礎(chǔ)值的205±23%;200mMO-Me-cAMP能抑制TNF-α誘導(dǎo)的TER的下降和FITC-BSA通透率的增加。抑制caveolin-1表達(dá),靜息狀態(tài)下TER較controlshRNA組升高到116±10%,FITC-BSA的通透率較controlshRNA組略有降低,但差

14、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。當(dāng)caveolin-1shRNA組和controlshRNA組細(xì)胞單層受TNF-α刺激2h,caveolin-1shRNA組TER的值降到刺激前的78±7%,controlshRNA組TER的值降到刺激前的59±4%,可見caveolin-1shRNA組TER值下降程度較controlshRNA組為少,兩組間比較(78±7%vs59±4%)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);觀察FITC-BSA通透率方

15、面變化可見:controlshRNA組在受到TNF-α刺激2h后,FITC-BSA的通透率明顯增加到刺激前的197±27%,caveolin-1-shRNA組通透率升高到刺激前的122±11%,兩組間比較有顯著性差異(197±27%vs122±11%,p<0.05)。敲除caveolin-1可以抵御TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮通透性的增加。Rac1的抑制劑-NSC23766能取消敲除caveolin-1帶來的內(nèi)皮屏障保護(hù)效應(yīng)。
　　2)抑

16、制caveolin-1表達(dá)對PMVECsF-actin和cortactin分布的影響:TNF-α刺激control-shRNA細(xì)胞2小時(shí)可見:F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整、排列紊亂,細(xì)胞邊界已不可辨,F-actin重組,從細(xì)胞周邊向細(xì)胞中心轉(zhuǎn)移并成平行束狀堆積、增厚,細(xì)胞中央應(yīng)力纖維形成,而胞漿中分布的cortactin變得紊亂,皮質(zhì)區(qū)和細(xì)胞膜上的分布也變得很不明顯;細(xì)胞邊界模糊,形態(tài)不清,而western-blot半定量

17、分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯減少。caveolin-1-shRNA組:F-actin重組明顯,從細(xì)胞中央向細(xì)胞周邊轉(zhuǎn)移并形成皮質(zhì)區(qū)F-actin增厚強(qiáng)化,細(xì)胞中央束狀應(yīng)力纖維形成明顯減少,細(xì)胞偽足形成明顯。而胞漿中分布的cortactin明顯向膜上轉(zhuǎn)位,在細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)分布明顯,并在細(xì)胞膜上成線樣強(qiáng)化分布;western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯增加。給予TNF-α刺激2h,皮質(zhì)區(qū)F-actin

18、分布強(qiáng)化依舊明顯,胞漿區(qū)F-actin分布比較紊亂,但細(xì)胞中央的束狀應(yīng)力纖維比較明顯,細(xì)胞偽足形成仍可見到;細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)和偽足區(qū)cortactin分布減少不明顯,胞漿區(qū)cortactin分布也沒有明顯減少,western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量較TNF-α刺激前減少不明顯,但是較control-shRNA+TNF-α組明顯增加。
　　3)抑制caveolin-1表達(dá)對Rac1信號(hào)通路活性的影響:抑制ca

19、veolin-1表達(dá)可以增加RPMVEC內(nèi)Rac1的活性,抑制TNF-α導(dǎo)致的RPMVEC內(nèi)Rac1活性的降低:在靜息情況下shRNA方法沉默caveolin-1基因表達(dá)可以明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞中Rac1酶的活性,較陰性沉默對照組(controlshRNA)升高2.5±0.2倍(n=6,P<0.01);而在TNF-α刺激2h后,caveolin-1-shRNA組Rac1酶的活性是controlshRNA組酶活性的2.7±0.4倍(n=6,P

20、<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建caveolin-1基因表達(dá)抑制的RPMVECs單層模型。
　　2.抑制caveolin-1表達(dá),可以減輕TNF-α所致RPMVECs單層通透性的增加。
　　3.TNF-α引起Rac1活性的降低,可能是其導(dǎo)致RPMVECs通透性增高的機(jī)制之一。抑制caveolin-1表達(dá)可以上調(diào)Rac1的活性導(dǎo)致皮質(zhì)區(qū)cortactin和F-actin骨架蛋白分布的增加,加強(qiáng)細(xì)胞間連接