酪氨酸蛋白激酶抑制劑(AG490)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性腫瘤,據(jù)報(bào)道,嬰幼兒血管瘤的發(fā)病率可高達(dá)10％,體重低于1000g的早產(chǎn)兒發(fā)病率高達(dá)22.9％。血管瘤的發(fā)病率有種族差異,白人的發(fā)病率高于其他種族,黑人的發(fā)病率最低;血管瘤的發(fā)病率也有性別差異,女性的發(fā)病率高于男性,比例約為3:1。血管瘤大多數(shù)(71％)位于頭頸部,位置比較表淺,也有少數(shù)發(fā)生在黏膜、肌、骨組織和內(nèi)臟,不僅影響美觀,而且影響生理功能,甚至危及生命。血管瘤是以血管內(nèi)皮細(xì)胞活躍增殖為特征的良性腫

2、瘤,且大多數(shù)血管瘤有一個(gè)快速增生和自然消退的過(guò)程。血管瘤一般在出生時(shí)并不存在,大多數(shù)出現(xiàn)在出生后1月內(nèi)。早期血管瘤生長(zhǎng)迅速,超過(guò)嬰兒的生長(zhǎng)速度,然后緩慢消退。根據(jù)其分子標(biāo)志、生長(zhǎng)特點(diǎn)及患者年齡,臨床上通常將其分為3期:快速增殖期(0-1歲)、消退期(1-5歲)和消退完成期(5-12歲)。血管瘤在經(jīng)過(guò)一個(gè)始發(fā)的快速增殖期后,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度減慢,腫瘤內(nèi)細(xì)胞成分減少,并逐漸被纖維脂肪組織所取代。約有50％的患者,瘤體在5歲時(shí)可完全消退,

3、至12歲時(shí)總的消退率達(dá)90％。
　　 目前國(guó)內(nèi)外治療血管瘤的方法主要有外科切除、放射治療、低溫治療、激光治療、硬化劑注射、抗癌藥物治療、類固醇激素治療等。目前,一種新型的治療手段-普奈洛爾治療血管瘤正逐漸被廣泛應(yīng)用,且取得了較好的臨床效果,但其具體的治療機(jī)制,還處于研究階段。而外科切除也只能針對(duì)小面積血管瘤,且術(shù)中出血量大,術(shù)后面部外形、功能難以恢復(fù)正常,給這些嬰幼兒血管瘤患者的身心健康帶來(lái)極大的影響。
　　 目前,血管

4、瘤的發(fā)病機(jī)理仍在探討中,其中生長(zhǎng)因子與血管瘤的關(guān)系受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。Bobling等人報(bào)道血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞自分泌堿性成纖維生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子,并且有相應(yīng)的受體表達(dá)。生長(zhǎng)因子作用于細(xì)胞膜受體上,通過(guò)激活酪氨酸蛋白激酶,使其磷酸化,啟動(dòng)Ras-MAPK(細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶)級(jí)聯(lián)反應(yīng),c-fos、ras、myc等原癌基因表達(dá),某些蛋白質(zhì)合成迅速增加,細(xì)胞進(jìn)入S期,迅速分

5、裂增殖。
　　 鑒于多種生長(zhǎng)因子參與血管瘤的生長(zhǎng)與增殖,因此單獨(dú)采用某一種生長(zhǎng)因子的單克隆抗體來(lái)抑制血管瘤的生長(zhǎng)是不可取的。本研究試圖通過(guò)多種生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用的共同中心環(huán)節(jié)—即抑制受體酪氨酸蛋白激酶的活性,使其不能磷酸化,啟動(dòng)細(xì)胞增殖的信號(hào)不能連續(xù)向下傳導(dǎo),從而抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。且所采用Tyrphostins AG490制劑細(xì)胞毒性小,降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒性,安全可靠,達(dá)到治療的目的。
　　 材料和

6、方法：
　　 1、樣本的收集收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院病理科2005-2007年皮膚血管瘤存檔蠟塊30例和同期血管畸形蠟塊26例;收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院新生兒外科6個(gè)月以內(nèi)的新生兒皮膚血管瘤3例;6例6個(gè)月以內(nèi)唇裂患兒裂隙周邊正常皮膚取自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科手術(shù)切除標(biāo)本;臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)于上海生科生物科技有限公司。
　　 2、免疫組化
　　 標(biāo)本切成5um切片,常規(guī)脫蠟至水,高壓抗原修

7、復(fù)。Hydrogen Peroxide Block中孵育30min。滴加適當(dāng)濃度一抗,4℃過(guò)夜,滴加酶標(biāo)二抗,DAB顯色。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 HUVEC培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清+100units/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中,置于35℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 4、MTT分析對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞以5×103細(xì)胞每孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于37℃,5％CO2過(guò)夜

8、培養(yǎng)。次日細(xì)胞貼壁后,吸棄培養(yǎng)基上清,換液為含AG490終濃度分別為0、10、20、30、60、120、240μM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,每孔200μl,同時(shí)設(shè)立空白組,分別培養(yǎng)24h、48h、72h進(jìn)行MTT檢測(cè),每孔加入DMSO溶液200ul,室溫下震蕩10min,選擇490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)。
　　 5、Realtime PCR檢測(cè)將獲得的總RNA,使用TIANScript RT Kit試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行r

9、eal-timePCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件95℃10min,95℃10s,60℃20s,72℃30s,4℃5min,35個(gè)循環(huán)。VEGF特異性引物:5’-CCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACT-3’/5’-CTCGGTGATTTAGCAGCAAGA-3’。COX-2特異性引物:5’-TCCCCTTCTGCCTGACACCT-3’/5’-TTCCTACCACCAGCAACCCT-3’。反應(yīng)結(jié)束后分析real-TimePCR的擴(kuò)增

10、曲線和融解曲線,用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　 6、Western blot鑒定使用VEGF、COX-2和p-KDR抗體進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),以檢測(cè)VEGF、COX-2和p-KDR蛋白的表達(dá)。組織及細(xì)胞樣本的蛋白提取,蛋白樣本的制備,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,雜交,顯色。
　　 7、Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,于37℃,5％

11、CO2過(guò)夜培養(yǎng)。次日細(xì)胞貼壁后,吸棄培養(yǎng)基上清,換液為含AG490終濃度分別為0、30、60、120μM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h,Hoechst33258染色,共聚焦顯微鏡下觀察,進(jìn)行圖像采集。
　　 8、流式檢測(cè)細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,加入含AG490終濃度分別為0、30、60、120μM的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,于37℃,5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)。然后進(jìn)行細(xì)胞固定、染色,進(jìn)行流式堅(jiān)持測(cè)。
　　 結(jié)

12、果：
　　 1、經(jīng)免疫組織化學(xué)染色、real-time PCR和western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),VEGF、COX-2和p-KDR在血管瘤組織中高表達(dá),與在血管畸形和正常皮膚組織中的表達(dá)有明顯差異(P＜0.05)。
　　 2、經(jīng)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HUVEC中VEGF和COX-2mRNA及蛋白的表達(dá)與正常皮膚組織之間存在明顯差異(P＜0.05),與血管瘤之間無(wú)明顯差異(P＞0.0

13、5)。
　　 3、MTT和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AG490可明顯抑制HUVEC的增殖;隨著AG490濃度增加,對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用顯著提高,VEGF、COX-2和p-KDR的蛋白表達(dá)有明顯下降的趨勢(shì);同時(shí),隨著加藥處理時(shí)間延長(zhǎng),抑制作用也存在上升的趨勢(shì)。但濃度過(guò)高、作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡較多,得出AG490濃度為30、60、120μM作用下,時(shí)間為48 h為最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間。
　　 4、H

14、oechst33258染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常未加藥對(duì)照組相比,HUVEC細(xì)胞經(jīng)AG490處理后,出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象,呈現(xiàn)致密濃染,說(shuō)明出現(xiàn)細(xì)胞凋亡情況;當(dāng)AG490濃度達(dá)到120μM時(shí),核染色質(zhì)凝集成月牙形,細(xì)胞凋亡加劇。
　　 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VEGF、COX-2和p-KDR在小兒血管瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá),并且與血管畸形內(nèi)皮細(xì)胞及正常皮膚組織上的表達(dá)有顯著性差異,提示它們可能在血管瘤的增殖及其生物學(xué)行為中起重要作用。